HPLC技术讲座系列之色谱柱的日常维护及应用解决方案(北京1).ppt

概 述 一、色谱柱的基本知识 分离原理 当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)，由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 高效液相色谱柱发展史 19世纪70年代中期，10 μm 的无定型硅胶颗粒。 80年代：粒径为5 ～ 10 μm 球形硅胶。 90年代早期：粒径为 5 μm 的高纯硅胶。 90年代后期：发展了 3 μm 或 3.5 μm 的球形硅胶。 21世纪早期：粒径小于 2 μm 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。 HPLC色谱柱及其填料的特征 HPLC 色谱柱的基质材料 硅胶与聚合物等 色谱柱结构 柱体 填料 硅 胶 基质材料 高机械强度和高的比表面积、高效。 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。 重现性好。 pH 适用范围为pH 2－8。 具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。 聚合物基质材料 硅 胶 外 形 球形硅胶: 现代 HPLC 填料 粒径小 (5 μm, 3 μm, 2 μm) 重现性好 稳定性好 分离效率高 硅 胶 纯 度 硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。 金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。 硅胶纯度 硅 胶 粒 径 硅胶孔径 Ultimate? 硅胶基质材料的孔径分布 键 合 相 键合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅胶、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 离子交换柱): 10% 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 C18 和 C8 在反相色谱中应用得最为广泛。 为什么反相色谱应用如此广泛? 它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。 保留机制可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。 选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。 UltimateTM不同键合相的选择性 封 尾 封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。 由于硅烷相对很大的体积，使得C18 和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的 50% 。 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形 二、色谱柱的正确使用和维护 使用前的准备工作 阅读使用说明书 HPLC的色谱柱接头 HPLC常用色谱柱接头： 正确的PH使用范围 液相柱---保留值与pH的关系 不同填料基质对PH不同的耐受表现 常见缓冲盐的PH值 正确的温度范围 相塌陷 正确的保存 典型的有机物分析流程图 样品前处理的一般原则： a、尽可能的除去样品杂质； b、使用流动相溶解样品； c、使用预处理柱（如：SPE小柱）除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质； d、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 固体颗粒物质堵塞筛板 保护柱和在线过滤器 缓冲盐的析出 强保留物质累积的维护方案 强保留物质累积的维护方案Welch公司色谱柱最佳维护方案 色谱柱再生（用下列每种溶剂20~30倍柱体积冲洗） 色谱柱柱体积 三、异常色谱峰产生的原因和解决方案 常见异常色谱峰： 前延峰； 拖尾峰； 叉峰（裂峰）； 宽峰/馒头峰。 前延峰解决方案 峰前延解决方案 峰分叉（裂峰） 进样溶剂化效应 其他原因及解决方案 保护柱填料与分析柱填料不一致 ---- 更换保护柱，最好使用相同 厂家相同品牌的保护柱和分析柱 流动相碱性过强 ----由于硅胶溶解使柱塌陷 宽峰/馒头峰 宽峰/馒头峰 四、色谱柱使用六大误区 色谱柱使用六大误区： 1、HPLC色谱柱不能反转使用： 反转后会出现填料塌陷、键合相无法展开 错误! 装填色谱柱压力，约8000psi； 装填方向和使用方向相反； 某些厂家前后筛板孔径不一致； 月旭公司的色谱柱两端筛板孔径是一致。 色谱柱使用六大误区： 2、保护柱不影响分离效果 ： 错误! 填料选择不当，引起保留