集成化蛋白质组定量分析系统2012CB91060生物分子高效分离.docVIP

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告 项目编号：2012CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究集成化蛋白质组定量分析系统按照项目任务书要求本课题在20年度主要针对集成化蛋白质组定量分析系统，侧重开展了研究工作超高灵敏度蛋白质定量分析系统。按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。鉴定到271个蛋白，鉴定到个蛋白group聚丙烯酰胺整体/低转移细胞株蛋白提取物分析，发现了24种蛋白质发生了明显变化； 在集成化蛋白质分析平台方面：1）构建了集成化蛋白质定量分析系统，实现了蛋白质酶解、在线标记、肽段分离以及质谱检测的集成化，可从10万个细胞中定量到约1700个蛋白质；2）构建了基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台RSD值为19.63%，用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高/低转移细胞系蛋白质提取物分析，发现7种蛋白质在低转移细胞中高表达， 9种蛋白质在高转移细胞中高表达； 在超高灵敏度蛋白质定量分析系统0.34 amol，相对偏差RSD1.58%，动态范围1-105；2）构建了二维阵列液相色谱系统提高了自动化程度和m）垂直固定在一铁夹中。用注射器吸取一定量的聚砜浆料注满枪头。取一段毛细管垂直正中插入枪头的浆料内并穿过枪头的出口端，再将毛细管上端垂直固定在一环内，并在毛细管的下端悬挂一重物。在枪头的正下方放置一杯纯净的去离子水，然后松开毛细管上端的环，毛细管在重物的重力作用下自由落入盛水烧杯中，2 min后将毛细管从水中取出。毛细管在下落的过程中管壁外表面均匀粘附一层聚砜，聚砜遇水即刻水解成膜。将毛细管从成形的膜中抽取出来便可得到一中空纤维膜，膜内径即为毛细管的外径，膜外径即为枪头出口端内径。利用该中空纤维膜制备了一种在线除盐接口，可将溶液中的盐浓度降低2个数量级，同时以肌红蛋白为例，对该膜接口的非特异性吸附进行了考察，该膜接口对蛋白质的回收率可达95%。 2.2 缓冲溶液置换接口 在集成化蛋白质分析平台中，各维之间溶剂的兼容性是实现在线分离的关键因素之一。因此，利用溶剂置换接口来进行溶剂交换是解决该问题的有效途径。本课题在前期工作的基础上，改进了制作方法，研制了无胶粘接卡套式中空纤维膜接口，用于提高蛋白质在处理过程中的回收率，具体制作步骤如下： 根据交换液腔管的长度截取适当长度的中空纤维膜一根。 将石英毛细管插入中空纤维膜两端，插入长度约1 cm。 将内插有石英毛细管的中空纤维膜两端套入两段Peek管内，Peek管的长度根据Peek接头的长度适当调整，大致为4 cm。 将两段带有Peek管的中空纤维膜装配入置换液腔管中。 将两段的Peek管套入Peek接头中，用二通将中空纤维膜卡住。膜接口即制作完成。 为了考察该接口对蛋白质样品的回收率，采用0.11 mg/mLBSA为样品，进样20 μL，通入中空纤维膜接口，收集组分通过BCA法测定浓度，BSA过膜后的回收率可达94%±1.3% (n=3)，可满足定量分析的需求。 2.3 亲水性IMER 2.3.1 基于聚合物微球基质的亲水性IMER 本课题利用N-乙烯基-2-吡咯烷酮所带有的双键与聚合物微球表面双键反应进行修饰，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺序列覆盖率为66.3±1.3%，鉴定肽段数目为37±2.7%浓度分别为100, 1 and 0.01 μg/mLMyo)、Cyt-c)和BSAMyo、Cyc和BSA覆盖率为%、40%和17%，鉴定肽段数目为自由溶液酶解序列覆盖率为%，鉴定肽段数目为明IMER的高的酶解效率1.5 min，通过LC-MS共鉴定到271个蛋白，自由溶液鉴定到192个蛋白，两者之间的overlap达到了88.5% 2.3.2 基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性IMER 本课题通过引入氧化石墨烯改善基质的亲水性利用磁性氧化石墨烯作为基质。首先在EDC/NHS活化下制备磁性氧化石墨烯，然后通过氢键和π-π作用，在磁性氧化石墨烯表面固载胰蛋白酶，酶固载量达到0.275 mg/mg。将上述IMER对标准蛋白进行酶解，鉴定到的序列覆盖率分别为%、%、%，鉴定肽段数目为、、，。进一步采用，鉴定到个蛋白group聚丙烯酰胺整体丙烯酰胺和N’N-双甲基丙烯酰胺分子聚丙烯酰胺整体柱一种新基于再生。传统方法，的再生只需要进行胰酶的解吸和吸附，金属离子的再次固定化。这种IMER对与飞摩尔的样品表现出良好的酶解能力。2362条肽段1163 独一肽段，FDR1%, 对应333种蛋白质α-酸性糖蛋白、胎球蛋白）对一体化定量分析方法的准确性、线性、回收率以及灵敏度进行了系统研究。首先证实了这一分析方法在定量糖蛋白组学分析中是准确可靠的，定量准确性可达到97%，其次研究表明该方法在糖肽的定量分析中，可以