蛋白质 第六组.pptVIP

核糖体展示技术mRNA展示技术 ———第六组 主要内容 1、原理 2、步骤 3、优点 4、发展历程 5、应用前景 核糖体展示技术通过PCR扩增目的基因的DNA文库，同时引入 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构， 将置于具有偶联转录-翻译的 无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面,形成 “mRNA-核糖体-蛋白质” 三元复合体, 最后利用常规的免疫学检测技术，通过固定化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT- PCR扩增，进行下 一步循环的富集和选择， 最终筛选出就有高亲和 力的目标分子。 核糖体展示技术原理 mRNA展示技术与核糖体展示技术的区别 复合体中的mRNA与蛋白质通过一个小分子共价连接，如嘌呤霉素 该复合体产生完全在体外，很容易构建大型突变文库（含1012~1013个独立序列）。 分析鉴定蛋白质功能及小分子药物 核糖体展示技术的基本流程 First generation 优点 体外无细胞体系中进行，避开了细菌转化、噬菌体包装、跨膜分泌、蛋白酶水解等种种限制。 利用mRNA可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。 大大提高了文库容量和筛选通量 增加了表达蛋白的溶解度 RD还具有建库和筛选方法简便，没有选择压力，通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等。 发展历程 20世纪80年代早期，一些研究小组利用沉淀法从细胞内的“mRNA—核糖体—蛋白质”复合物中分离特殊的mRNA分子，并获得成功。 90年代发现，当mRNA缺乏终止密码子并经适当修饰以后，可形成十分稳定的“mRNA—核糖体—蛋白质”复合体 1997年，Pluckthum实验室在前人的基础上，建立了体外筛选完整功能蛋白质的新技术——核糖体展示技术。 核糖体展示技术的应用前景 制备抗体（单链抗体） 确定抗原表位 改进功能蛋白的活性 筛选配体、受体 筛选新的蛋白酶抑制剂 从免疫小鼠的脾脏 中提取总RNA 体外转录成mRNA 构建scFv的核糖体展示模板 在大肠杆菌或真核细胞核糖体系统中翻译 亲和筛选出特异的核糖体复合物 通过EDTA解聚，从核糖体复合物中分离mRNA mRNA逆转录成cDNA,并通过PCR扩增获得侯选DNA 下一轮循环的富集、筛选 克隆和序列分析及表达、活性分析 核糖体展示技术构建及表达scFv基本步骤 RT-PCR扩增抗体库基因 mRNA展示技术 主要内容 1、定义 2、原理 3、步骤 4、优点 5、发展历程 6、应用前景 定义 mRNA展示技术又称mRNA-蛋白质融合体展示技术，是一种新兴的体外多肽筛选技术。可以运用于生物分子配体的发现和相互作用的分析。 原理 嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成 稳定的酰胺键，使mRNA 的3’端与多肽的羧基 端共价结合起来。 步骤 （1）化学合成编码多肽库的DNA库，并对DNA进行特殊加工，在5‘端添加T7聚合酶启动子、翻译增强子、翻译起始密码子等序列；在3’端添加亲和纯化标签。 （2）在体外利用T7聚合酶将DNA转录成RNA，把RNA的3‘端和带有嘌呤霉素的连接子结合，带有嘌呤霉素连接子的诱饵RNA和RNA文库在无细胞系翻译体系中共翻译，通过嘌呤霉素的作用，mRNA与其所翻译的蛋白质结合起来形成mRNA-蛋白质融合体，从而实现了基因型(mRNA) 和表型（蛋白质）的结合。 （3）利用翻译蛋白所带的亲和标签，用亲和层洗技术将mRNA-蛋白质融合体纯化出来，并对mRNA进行反转录，生成cDNA-mRNA-蛋白质融合体。 （4）采用ELISA、磁珠法等，将筛选的靶物质固定化于固相载体上，含有目标蛋白的cDNA-mRNA-蛋白质融合体就能与固相载体上的靶物质特异性结合而得到分离。 （5）通过洗脱液将猎物cDNA-mRNA-蛋白质融合体洗脱下来，加酶分解得到cDNA，将其进行PCR,所得产物进入下一轮循环。经多次循环，目标蛋白及其编码的基因序列得到富集和分离。 mRNA-多肽融合技术的基本流程 Second generation 优点 作为一种体外展示技术，mRNA具有多肽库容量大、筛选效率高、操作简便等共同特点。反转录的cDNA/mRNA的杂交双链，避免了RNA二级结构、三级结构对体外筛选的干扰。 应用 主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物在细胞中的相互作用机制。其他可能的特殊运用有自组装蛋白质芯片、非天然氨基酸的文库和多肽的化学修