淀粉酶米氏常数测定(1).pptVIP

淀粉酶米氏常数的测定 一、 实验目的 了解并掌握米氏常数的意义和测定方法 二、 实验原理 三 仪器和试剂 试管 移液抢 秒表 吸耳球 恒温水浴锅 7200型分光光度计。 三 仪器和试剂 试剂 （1）酶液：精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U／g计)，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用 （2）原碘液 称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘-碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。 （3）稀碘液 取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。 （4）4％可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却后定容至100 mL, 此溶液现配现用。 （5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000 mI。 （6）0.2moL/L HCl 取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。 四、实验操作 1. 淀粉浓度梯度吸光度 不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表1操作） 不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）可溶性淀粉4mL，缓冲液0.75mL，摇匀后，在60℃水浴中平衡5 min，加入0.25 mL稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应10 min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表2操作）。 酶的反应速度V：以单位时间内吸光度的减少量d(A0-A1)／dt来表示 以1/v 对1/[S]双倒数法作图 计算Km值。 五、实验注意事项 取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 分光光度计的正确使用。 取液器的使用 六、思考题 (1)?试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。 (2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？ * * 生物化学实验之八 安徽师范大学生科院生化教研室 酶促反应v-[S]曲线 推导出米氏方程为： 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，斜率为Km/ Vm。通过Lineweaver-Burk作图法作图后可方便的求出Km值。 A660 取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色 加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀 充分摇匀，60℃放置10min 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 蒸馏水(ml) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 缓冲液(ml) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 H2O(ml) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 4%可溶性淀粉（ml） 6 5 4 3 2 1 瓶号 试剂 2. Km测定 1/v v 1/[s] [s] 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 可溶性淀粉量浓度% A660 取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色 取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl 充分摇匀，60℃放置10min 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 酶液(ml) 60℃放置，预热5min 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 缓冲液(ml) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 H2O(ml) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 4%可溶性淀粉（ml） 6 5 4 3