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实验四 蛋白质含量的测定 【目的和要求】 【实验原理】 【实验方法】 【注意事项】 【思考题】 * 1. 了解Folin酚法（Lowry法）和考马斯亮蓝G250法（Bradford法）的基本原理。 2. 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的基本操作。 3. 学会使用722型分光光度计的使用方法。 Folin酚法（ Lowry protein assay ） 福林酚法试剂 包含两部分 试剂甲：Na2CO3、 NaOH、CuSO4 及 酒 石酸钾钠组成 试剂乙：磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴组成 蛋白质 （肽键） Tyr Trp Cys Folin酚甲Cu2+? Cu+ 测定范围约在25-250μg / ml 蛋白质。 钼蓝和钨蓝 Folin酚乙 （?650nm处比色） 测定范围1-100μg / ml蛋白质。 蛋白质 + 考马斯亮蓝 深蓝色化合物 （?595nm处比色） （Arg, 疏水性氨基酸） 考马斯亮蓝G250法（Bradford protein assay） Modified Lowry o Range: 25-250μg / ml o Accuracy: Good o Convenience: Fair o Major interfering agents: Strong acids, ammonium sulfate Bradford assay o Range: 1-100μg / ml o Accuracy: Good o Convenience: Excellent o Major interfering agents: None A或OD ：光吸收(absorbance)或光密度(Optimal Density) ? ：摩尔消光系数 C：样品摩尔浓度 l：比色杯的内径长度 I0：入射光强度； I ：透射光强度； T (transmittance)： 透光率（ I1 / Io ） A=Lg（ Io/I1） = Lg（1/T）= ? C L 分光光度法测蛋白质含量-----Lambert-Beer 定律 标准曲线法 根据Lambert-Beer 定律，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。通过配制一系列不同浓度的标准蛋白，测定特定波长下的吸光度值， 制作标准曲线。 根据样品的吸光度值，计算蛋白质浓度。 Spectrophotometer分光光度计（722型）的使用 开盖预热 调节波长 调节透光率 闭盖 T=100 开盖 T=0 闭盖 A=0 （一）样品的制备 溶菌酶样品：制备及纯化方法见实验三 （二）标准曲线的制作与样品测定 0.5 0.5 混匀，室温下放置5~30分钟，595nm读光密度值 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 G250 0.7 0.7 0.7 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 dH2O（ml） 0.3 0.3 0.3 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白溶液（ml） 7 8 9 6 5 4 3 2 1 管号 B 混匀，30℃15~30分钟，650nm读光密度值 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 F乙 混匀，室温下放置10分钟 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 F甲 0.5 0.5 0.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 dH2O （ml） 0.5 0.5 0.5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白溶液（ml） 7 8 9 6 5 4 3 2 1 管号 A 溶菌酶样品 标准曲线 A 250 200 150 100 50 0 标准蛋白含量（?g） 7 8 9 6 5 4 3 2 1 管号 溶菌酶样品 标准曲线 三、样品蛋白含量计算 A 100 80 60 40 20 0 标准蛋白含量（?g） 7 8 9 6 5 4 3 2 1 管号 溶菌酶样品 标准曲线 Lowry法 Bradford法 制表 蛋白质含量计算 根据标准曲线，求出溶菌酶样品的含量。 绘制标准曲线 蛋白质样品和显色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去。 2.染料与蛋白质形成的蓝色化合物易轻度沾附试管壁或比色皿，使用完应立即冲洗干净。 3.待测样品的浓度超出测定范围时，应对样品做适当处理，使其浓度在标准曲线测试范围内。 *