目的基因的制备与克隆.PPT

大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 一、材料 提纯TMV病毒液（10mg/ml）。 二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽 三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。 四、操作步骤 1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。 2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。 4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。 5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。 6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。 7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。 由于mRNA末端含有多poly(A)，当总RNA流径oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是在 cDNA 的合成过程中加入高浓度的 Oligo（dT）引物， Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3‘ 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。 随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5‘-端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。 第四 双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 双链 cDNA 在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。1．同聚物加尾 　　　　该方法只对质粒有效，尾的长短不一（100dA/dT , 20dG/dC）。同聚尾结合的质粒： cDNA 杂合分子转化 E.coli 的效率随宿主不同而不同。 2．合成接头和衔接头 ?? 一种方式是单酶切位点连接策略: 直接在第二链上通过平端连接导入接头，当导入的粘端接头已经去磷酸化，则可以直接用于连接；当导入的粘端接头带有活性磷酸基团时，所加接头需选择甲基化敏感的酶且加接头之前必须对双链 cDNA 进行甲基化处理，加上接头后再用该酶进行消化，创造用于连接的粘端。 另一种方式是双酶切连接的策略，一般在第一链合成时在 cDNA 的 5-端引入一稀有酶切位点，如 NotⅠ，在双链 cDNA 平端连接上去磷酸化粘端的接头，如 SalⅠ ，然后用 NotⅠ 酶切创造出另一端的粘端，这样可以与对应双酶切载体连接。同时，双酶切连接可以对插入的 cDNA 具有定向的作用 衔接头（adaptor） 　　　一种化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制酶识别序列。其与连杆的重要差别是衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产生的粘性末端。 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。 mRNA 分离 用纤维素柱纯化poly(A) mRNA的流程图 　　所有cDNA第一链的合成方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。 第二 第一链 cDNA 合成