鼠肝DNA的制备.pptVIP

鼠肝DNA的制备 ——高分子量DNA的提取和纯化 以DNP、RNP形式存在。 策略： 1、破细胞----SDS破坏细胞膜 2、去蛋白----苯酚（蛋白变性剂） 3、除RNA----RNase 实验原理 DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础 研究遗传、疾病发生的基础 研究的前提：DNA的提取 本实验用SDS、EDTA ，在Tris-HCl存在的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内存在的DNA酶失活，然后用苯酚—氯仿有机溶剂多次抽提后，用乙醇沉淀得到纯化的DNA。 DNA大小为100－150kb 。 裂解缓冲液：Tris-HCl pH7.8 维持pH恒定，防止DNA变性和水解；EDTA能络合二价金属离子，当Mg2+被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。 试剂作用 Phenol、Chloroform 、Proteinase K and RNase Phenol：苯酚，强烈蛋白变性剂，去蛋白。注意盖紧离心管 Chloroform：氯仿，蛋白变性剂，能加速有机相与液相分离。 并有抑制RNase的作用。 Proteinase K：蛋白酶K，能水解与DNA结合的核蛋白以及细 胞质中会降解DNA的酶。可与EDTA、SDS合用。 RNase：去除RNA 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上 提取，应贮存－70℃或液氮 组织匀浆法 实验操作：样品准备 实验操作（1）： + 1mlTE溶解 +2.5V冰乙醇； 0.1MNaCl 白色絮状沉淀 70% 乙醇洗涤 +RNase 20ul +等体积苯酚：氯仿 10000rpm，5min 鼠肝匀浆液 1/3管匀浆液 水相 轻缓混匀 塑离 刻度离心管 37℃ 30min 50℃ 30min +等体积酚：氯仿 塑离 轻缓混匀 10000rpm，5min 水相 +2.5V冰乙醇； 0.1MNaCl 颠倒混匀 20%SDS 25ul； EDTA 30ul； PK 20ul 刻度离心管 实验操作（2）： 取1.5ul，OD260/OD280比色 PCR 纯度、浓度、总量 沉淀加0.3-0.5mlTE溶解 定性、定量 70% 乙醇洗涤 白色絮状沉淀 余原液 白色絮状沉淀 Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands. 1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1) 匀浆时应保持低温(冰浴中)，匀浆时间应短(30秒／次，2次)，勿用玻璃匀浆器。 (2) 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。 (3) 苯酚-氯仿抽提时勿剧烈振摇。 2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。 3.苯酚是一种强烈的蛋白变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛苯酚的试剂瓶、离心管盖紧。 4.离心管配平；滴管、移液枪的使用。 注意事项 DNA的鉴定—紫外分光光度法 1、鉴定纯度 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，OD260与OD280之比应在1.75－1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有RNA残留。 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.6-1.8） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，A260/A280＜1.6 若溶液中含有RNA， A260/A280＞2.0 2、含量计算 测定DNA在260nm的光吸收，计算浓度：?g/ml OD260nm×稀释倍数×50 ?g/ml ×1/光径 = ?g/ml（双螺旋DNA ） 1 OD相当于: 50 ?g/ml DNA 40 ?g/ml RNA 20 ?g/ml 寡核苷酸 计算： DNA纯度 DNA含量 DNA总量 保持核酸分子一级结构完整性和纯度。 防止外界机械性损伤（动作轻柔、钝口滴管） 完整性： 防止变性（温度、pH） 防止降解（DNa