从红枣中提取黄酮及其抗氧化活性鉴定.docVIP

从红枣中提取鉴定总黄酮及其抗氧化能力的测定 【研究意义】 红枣原产我国,在我国各地均有栽培,以色红、肉厚、饱满、核小、味甜者为佳。现代营养学研究证明,红枣含有蛋白质、糖类、有机酸、脂肪、人体所必需的氨基酸以及铁、锌、磷、钙、硒等,同时还含有丰富的VC、VP、VA、VB1、VB2等,是“活维生素丸”。红枣除上述常见的营养素外,随着近几年人们对红枣功能成分和药理的深入研究,发现红枣还含有一些其他水果没有或含量很少,但具有很高生理活性的特殊生物活性成分,如红枣多糖、黄酮、三萜类化合物、腺苷、生物碱和甾醇等。 黄酮类化合物有预防心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌、抗炎、抗过敏、止血镇痛等诸多功效,已列为保健食品的一类功能因子。黄酮类化合物的提取方法主要有:有机溶剂提取法、碱性稀醇或碱性水提取、超滤法、超声波提取法、微波提取法和酶法。 近来的研究表明,黄酮体化合物有强烈的抗氧化性质,作用于氧自由基和脂过氧化物,而这些物质是一些疾病如动脉粥样硬化、癌和慢性炎症发生的病理条件。许多黄酮类化合物是有效的自由基消除剂,它们具有较高地稳定性,可作为天然抗氧化剂,一些糖苷与之结合时,还会加强其稳定性和抗氧化能力。 【实验目的】 学习从红枣中提取黄酮的原理和方法。 学习掌握黄酮的鉴定方法。 【实验原理】 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在 ，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。W(%)= ×100% W:黄酮的提取率（%） C:样品溶液的浓度（mg/ml） V1:供试液体的体积（ml） V2:样品的稀释倍数 m:原料的质量（g） 减压浓缩、真空干燥（得到总黄酮）。 （Ⅱ）鉴定： 三氯化铝反应： 将样品溶于1ml的甲醇中，点样在滤纸上，晾干，喷晒1%的三氯化铝乙醇溶液（或者5%的三氧化铝的水溶液），干燥后黄色斑点于紫外荧光观察明显显黄绿色荧光。 HCl-Mg粉： 取1ml提取液于试管中加镁粉少许振摇，滴加2~3低盐酸（1次加入），1~2min内（必要是加热）即出现颜色。多数黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮类显红—紫红色，黄酮类显橙色，异黄酮及查尔酮类无变化。 3、四氢硼钠：取样溶于甲醇，加NaBH4，再滴加1%浓盐酸或浓硫酸，二氢黄酮呈红~紫色，其他黄酮类不反应。 （Ⅲ）抗氧化能力的测定： 先将提取物用双蒸水配置成浓度不同的梯度，在10ml的比色管中分别加入4ml（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入不同浓度样品液1ml，再加入在25℃水浴中预热0.2mmol/L邻苯三酚溶液1ml（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用弄HCl；两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。每管做3个重复，取平均值。 同上述过程，只是用1ml蒸馏水代替样液，测定结果为原始管（A原）。每管做3个重复，取平均值。 计算结果： O2- 清除率（%）= ×100% A样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+1mlHCl(0.05mol/L)代替邻苯三酚溶液 A原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+1mlHCl 4、将抗坏血酸制成浓度梯度，与提取液一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力，方法同样品测定，只是将样品用抗血酸代替即可。 附：实验结果 枣黄酮提取液的吸光值： 稀释倍数 吸光值 收集体积（ml） 粗提液 2 0.422 100 纯化液 1 0.265 132 芦丁标准曲线：y=9.6345x-0.0014 R2=0.9998 提取的枣黄酮浓度： ①稀释粗提液浓度x1：0.422=9.6345x-0.0014 ②纯化液浓度x2：0.265=9.6345x-0.0014 ①粗提液的提取率： ×100%= ②纯化液的提取率： ×100%= 黄酮的鉴定： ①三氯化铝反应：呈现黄绿色荧光； ②HCl-Mg粉：呈橙色； ③四氢化钠：无变化。 抗氧化能力测定： 吸光值1 吸光值2 吸光值3 A原 0.038 0.038 0.037 A1（不稀释） 0.022 0.021 0.023 A2（稀释2倍） 0.028 0.029 0.028 A3（稀释3倍） 0.033 0.034 0.032 抗坏血酸1（不稀释） 0.018 0.016 0