组织免疫共沉淀.docVIP

实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于后续实验。或1.??使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2.??将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。 3.??每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 4.??用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时 5.??12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。主要步骤：1.??每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时 2.??加100 μl Preotein A/G agarose beads， 4°C缓慢摇动10-30分钟 3.??14,000 x g 4°C离心10分钟 4.??取上清，弃沉淀 为提高蛋白回收率，可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次，所得上清和前面的合在一起Note：要确保最大可能将正常血清（或无关Ig）从标本中去除。第三步：免疫沉淀1.??取10-500 μg细胞裂解物，加入推荐量的抗体：抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参考以下数据：. o??多抗血清：1-5 μl o??亲和纯化的多抗：1 μg o??腹水（单抗）：0.2-1 μl o??培养上清（单抗）：20 -100 μl 2.??4缓慢摇动孵育1h到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力 3.??同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠：根据抗体类型选择合适的beads（参考附表2），如果IP抗体是IgM：不使用protein-A/G beads，直接使用Goat anti Mouse IgM beads。 4.??加入混匀的70-100ul protein-A/G beads，4缓慢摇动4h（根据具体实验优化孵育时间) 5.??2500rpm(约1000g) 4°C离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。 6.??用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。 7.??最后一次洗涤后，去除上清，加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液，95-100°C煮沸5分钟（将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。 Loading buffer是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液（up to 1 M）从抗体上洗脱下来。附1：免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂裂解buffer中各种成分的