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实验3 紫外分光光度法测定蛋白质含量
二、紫外分光光度法测定蛋白质含量; 利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。;【仪器与试剂】 1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。 2. 标准蛋白质溶液：0.9%?NaCl溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。 3. 待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.0-2.5mg/ml 4. 0.9%?NaCl溶液 5. 试管1.5cm×15cm（×9） 6. 移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml（×2）。;【实验步骤】 1、标准曲线法 （1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。; （2）样品测定：? 配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 2. 直接测定法 在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260? (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。; 本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。 【注意事项】 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性??差。 【思考题】 1.?紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？
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