art1对upa基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌ct26细胞侵袭转移中的作用word格式论文.docx

英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称ART1Arginine-specificmono-ADP-ribosytransferase-1精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1DNMT1DNAmethyltransferase1DNA甲基转移酶1BSPBisulfatesequencingPCR亚硫酸氢盐测序法PCRPARPpoly-ADP-ribosepolymerase聚腺苷二磷酸核糖聚合酶APAmmoniumpersulphate过硫酸铵DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜PMSFPhenylmethlsulfonylfluoride苯甲磺酰氟PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PVDFPolyvinylidinedifuoride偏二氟乙烯印记膜FBSfetalbovineserum胎牛血清TBSTris-HClbufferedsolutionTris盐酸缓冲盐NF-kBnuclear factor-kappaB核因子kBuPAurokinaseplasminogenactivator尿激酶性纤溶酶原激活剂SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠1ART1对uPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用摘要目的：探究精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1（Arginine-specificmono-ADP-ribosytransferases-1，ART1）对uPA基因启动子甲基化的影响及其在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用。方法：本实验以CT26细胞ART1高表达组（GFP-ART1）、ART1 沉默组（GFP-shART1）为实验组，CT26细胞空载体组（GFP-Vector 组）、未转染组（Un-transfection组）为对照组，western blot 测定不同组别DNA 甲基转移酶1（DNMT1）表达变化，同时，ART1 高表达组、ART1沉默组、空载体组及未转染组CT26细胞分别接种于BALB/C小鼠，构建各组别BALB/C小鼠脾脏移植瘤模型并提取各组移植瘤组织蛋白，Westernblot测定不同组别DNA 甲基转移酶1（DNMT1）表达变化。DNA甲基化特异性PCR测序法检测不同组别uPA基因启动子甲基化状态变化；免疫共沉淀方法观察CT26细胞ART1 高表达组、空载体组及未转染组ART1与DNMT1之间的关系。应用DNA 甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2-dc）处理ART1 沉默组CT26 细胞，划痕实验和Transwell侵袭实验观察细胞迁移及侵袭能力的变化。BALB/C小鼠脾脏接种ART1基因沉默CT26细胞，腹腔注射5-aza-2-dc，2与对照组比较小鼠脾脏移植瘤细胞肝转移情况。采用westernblot检测GFP-shART1、GFP-ART1、Un-transfection及GFP-Vector各组肿瘤细胞uPA表达变化，同时检测各组细胞脾脏移植瘤uPA表达变化，并应用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2-dc处理ART1沉默组CT26 细胞，westernblot 方法检测其uPA 表达变化，同时检测5-aza-2-dc处理沉默组与未处理沉默组脾脏移植瘤uPA表达变化。结果：（1）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞uPA基因启动子甲基化水平的影响：westernblot方法检测ART1高表达组、ART1沉默组、未转染组、空载体组CT26细胞DNMT1 表达变化，结果显示，与对照组相比，ART1高表达组DNMT1表达减少，而ART1沉默组DNMT1表达增加（P0.01）；同时检测各组小鼠脾脏移植瘤蛋白中DNMT1表达变化，结果显示同样的趋势（P0.01）；采用DNA甲基化特异性PCR 测序方法测定uPA启动子甲基化水平在各组的变化，结果显示与对照组相比，ART1高表达组uPA基因启动子甲基化水平降低，而ART1 沉默组uPA基因启动子甲基化水平升高。免疫共沉淀结果显示ART1 与DNMT1之间尚未发生直接的结合。（2）ART1 通过对uPA基因启动子甲基化状态的影响导致其表达变化及其在小鼠结肠癌CT26 细胞侵袭、转移能力的作用：细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测5-aza-2-dc处理组和未处理组CT26 沉默细胞迁移及侵袭能力，结果显示与未处理组相比，5-aza-2-dc 处理组细胞24h迁移距离明显增高（P0.01），且降解Matrigel基质胶穿过3小室的细胞数明显升高（P0.01）。采用5-aza-dc处理沉默组CT26细胞构建小鼠脾脏移植瘤模型，观察小鼠肝转移情况，结果显示与未处理组相比，处理组小鼠肝转移模型的肝脏转移结节数（P0.05）和肝脏