baff与taci相互作用功能结构域及关键氨基酸的分析word格式论文.docxVIP

PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PDBProteinDataBank蛋白质结构数据库RArheumatoidarthritis风湿性关节炎SDSsodiumdodecyl sulfate十二烷基硫酸钠SLEsystemiclupus erythematosus系统性红斑狼疮SSSjogrens syndrome干燥综合征TACITransmembraneactivatorandCAML interactor,TNFRSF13B跨膜激活物与亲环素配体相互作用物TMB3,35,5-TetramethylBenzidine3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TNFtumornecrosisfactor肿瘤坏死因子Tristrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷TrxThioredoxin硫氧还蛋白BAFF与TACI相互作用功能结构域及关键氨基酸的研究摘要B细胞激活因子(Bcellactivatingfactor,BAFF)是1999年发现的TNF超家族成员之一，它可特异性的刺激B 淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体，对B 细胞的存活和发育起到重要的调控作用。BAFF-R(BR3)、TACI、BCMA分别是BAFF 的三个受体,它们分布在B细胞分化发育的不同时期，BAFF正是通过这些受体在B细胞分化发育的各个阶段及免疫调节中发挥的作用。研究表明：BAFF缺乏会导致外周B细胞成熟缺陷和降低免疫球蛋白的水平；而BAFF过表达则会破坏免疫耐受，与许多自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)，sjogren氏综合症，类风湿关节炎(RA)的发生、发展密切相关。因此，BAFF及其受体作为治疗自身免疫疾病的特异性靶标，受到广泛的关注。受体TACI与BAFF具有高亲和力，它可以特异性识别BAFF并与之结合。因此，可溶性受体融合蛋白（TACI-Fc）可作为BAFF抑制剂治疗自身免疫疾病，目前该抑制剂已经进入临床试验阶段并取得初步成效。同时，新型拮抗剂开发已成为目前的研究热点。然而，BAFF是如何识别TACI发挥功能尚不十分清楚，确定BAFF与TACI相互作用的关键功能位点对于研制新型拮抗剂具有重要的指导意义。本研究基于配体（BAFF）和受体（TACI）晶体结构以及理论模拟获得的三维构象，借助计算机辅助分子对接技术、动力学模拟技术构建配体-受体相互作用的复合物模型，通过计算机模拟的方式分析TACI与BAFF的结合模式以及BAFF被TACI识别的关键区域。利用分子生物学突变实验以及功能评价方法对理论预测的抗原表位进行实验验证。具体工作如下：一、通过分子生物学、免疫学等方法完成人BAFF蛋白胞外段的表达纯化及活性鉴定。（1）将实验室保存的pET32a(+)/BAFF、pET32a(+)/TACI质粒进行原核表达、通过融合蛋白上携带的His标签进行镍离子亲和纯化，将获得的蛋白（rhBAFF、rhTACI）通过SDS及WesternBlot完成特异性鉴定；（2）通过非还原电泳、WesternBlot、HPLC对rhBAFF在PBS缓冲液中的存在形式做了分析；（3）用ELISA方法检测了rhBAFF与rhTACI 的结合活性，并与商品化蛋白进行了比较；（4）通过小鼠B细胞增殖实验在体外验证了rhBAFF的功能活性；二、借助计算机模拟的方法、通过生物学实验验证确定rhBAFF与TACI相互作用的重要区域。（1）借助BAFF以及受体TACI晶体结构，选择合适的力场参数，在考虑溶剂效应的情况下，利用计算机辅助分子对接技术经动力学模拟构建BAFF与受体相互作用空间构象；（2）利用分子生物学方法构建rhBAFF区域突变体的原核表达载体，在体外表达纯化及鉴定并通过非还原电泳和HPLC的方法鉴定三聚体结构；（3）通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学分析比较rhBAFF、rhBAFF区域突变体与TACI的结合能力的差异；（4）通过小鼠B细胞增殖实验以及经典NF-κB的激活实验在体外评判rhBAFF与突变体功能活性的差异，确定TACI识别BAFF的功能域；三、在确定rhBAFF功能域的基础上进一步对功能域中每个氨基酸位点进行理论模拟，选择关键位点进行研究，经实验评价确定了rhBAFF与TACI相互作用功能域的重要位点。（1）利用获得的TACI与BAFF作用复合物空间结构，通过计算机辅助虚拟突变技术对203~211、233~238结构域进行逐点虚拟扫描突变，通过相互作用能量的变化进而预测TACI识别BAFF的关键位点。（2）利用分子生物学方法构建rhBAFF单点突变体的原核表达载体，完成突变体的表达纯化及鉴定；（3）通过ELISA及Octet蛋白相互作用动力学分析比较rhBAFF、rhBAFF单点突变体与TACI的结合能力的