botxa注射咬肌对大鼠下颌骨发育的实验研究word格式论文.docxVIP

BoTx/A 注射咬肌对大鼠下颌骨发育的实验研究目的：中文摘要本研究拟通过 BoTx/A 注射 SD 大鼠咬肌诱导其产生偏颌，建立偏颌模型，并在建立的模型上观察 BoTx/A 对咬肌化学去神经后，髁突软骨的组织学变化， 并检测相关因子表达的时空变化，阐述在体内实验条件下，咀嚼肌应力变化对髁 突软骨的作用机制及其对下颌骨发育的影响，并用体外实验观察成肌细胞系及离 体肌组织收缩产生的条件培养液对成骨细胞系的影响，从而对肌肉影响骨发育的 机制进行初步探索，以期为下颌骨生长发育的研究提供科学参考。方法：1）实验动物及分组：将 96 只 4 周龄雄性 SD 大鼠随机分成 2 组，实验组与假手 术组（对照组），实验组咬肌注射 BoTx/A，对照组咬肌注射等量生理盐水。每组 12 只，分别观察 1、2、3、4 周。2）实验组动物模型的建立：SD 大鼠 28 日龄时进行实验，麻醉状态下暴露右侧 咬肌，注射 1 单位 BoTx/A。3）对照组动物模型的建立：SD 大鼠 28 日龄时进行实验，麻醉状态下暴露右侧 咬肌，注射与实验组等量生理盐水。4）Micro-CT 扫描及下颌骨测量：到达观察时间节点时，将大鼠处死取下头颅进 行 Micro-CT 扫描，并对下颌骨长度和高度进行测量，测量指标如下，将喙突到 颏前点的连线定义为 CoL，将髁突到颏前点的连线定义为 CdL，将下颌角点到 颏前点的连线定义为 GoL；将喙突后缘到下颌下缘平面的垂线定义为 CoH，将 髁突前缘到下颌下缘平面的垂线定义为 CdH，将下颌切牙到到下颌下缘平面的 垂线定义为 MeH。5）组织学及免疫组化染色观察：完成大鼠头颅 Micro-CT 扫描后，分别取实验 组与对照组左右侧新鲜下颌骨髁突颞下颌关节标本，于 4%多聚甲醛溶液固定后， 进行 EDTA 常规脱钙，脱钙完成后进行包埋切片，HE 染色进行组织学观察，免 疫组织化学染色观察 Sox9、Runx2 因子的表达。 6）肌肉相关生长因子条件培养液的生成：①C2C12 细胞用含 10%FBS 的高糖 DMEM 培养基，置于 37℃，5%二氧化碳培养箱中静置培养，当细胞到达 70-80%密度时， 换用含 2.5%马血清的 DMEM 培养基作为分化诱导培养液，24 小时后可以观察到肌小管的收缩，同时收集条件培养液；②取 4-5 月龄 C57BL6 雄性小 鼠趾长伸肌、比目鱼肌，于林格氏液中离体静置 20 分钟，之后对肌肉进行牵张， 以 500ms，80HZ 的频率刺激肌肉，并以每分钟 1 次的速度持续 20 分钟，之后更 换新鲜林格氏液，按前面提及的条件刺激 30 分钟，30 分钟后收集条件培养液。③将生成的条件培养液按 1%的浓度对 IDG-SW3 细胞进行培养，观察其 24 小时 和 48 小时的增殖活性，对 MC3T3-E1 细胞进行培养，观察其 24 小时和 72 小时 的增殖活性。7）免疫印迹法检测蛋白表达：用生成的条件培养液按 1%，10%的浓度对 IDG- SW3 细胞进行培养，观察 3 天、7 天、14 天、21 天、28 天，提取细胞总蛋白， 用免疫印迹法检测 E11、Sclerostin、β-actin 的表达。8）统计学分析：运用 SPSS21.0 软件进行统计学分析，两组数据之间比较用配对t 检验，三组间比较用单因素方差分析，当 p＜0.05 时有统计学意义。 结果：第一部分：实验大鼠全部存活，Micro-CT 扫描结果显示咬肌注射 BoTx/A 后， 实验组大鼠在注射后第 1 周开始下颌骨向注射侧偏斜，偏斜 0.5 个切牙的距离，在第 4 周，偏斜距离达 2 个切牙的距离，而对照组大鼠下颌则无偏斜。对下颌骨 的测量结果发现，在同一观察时间点，实验组大鼠下颌骨注射侧测量数值小于非 注射侧测量数值，差异有统计学意义，且随着时间的推移，差异持续存在；而在 同一观察时间点，对照组大鼠双侧下颌骨测量数值差异无统计学意义。第二部分： 组织学观察下颌骨髁突发现在实验组注射侧髁突软骨总厚度与非注射侧髁突相 比较在注射后 1 周出现增加，并持续到第 4 周，而与对照组大鼠的髁突相比，同 一观察时间点的髁突总厚度小于对照组。免疫组化结果发现在实验组右侧髁突， Sox9 的表达在注射后第 2 周出现增加，并持续到第 3 周，在第 4 周，在实验组 的非注射侧髁突，Sox9 的表达出现增加；实验组在注射后第 1 周，两侧髁突也 未见 Runx2 的表达，在注射后第 2 周，两侧髁突开始出现 Runx2 的表达，但无 明显差异，在注射后的第 3、4 周，在两侧髁突可见少量 Runx2 的表达，但由于 注射侧髁突的软骨厚度开始增加，Runx2 的表达显得多于非注射侧，且远远小于 相同观察时间点的对照组。第三部分：用收集的条件培养