cyp3a41g对hepg2细胞cyp3a4基因表达的 调控作用及机制word格式论文.docxVIP

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cyp3a41g对hepg2细胞cyp3a4基因表达的 调控作用及机制word格式论文

学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者:日期:年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者:日期:年月日CYP3A4*1G对HepG2细胞CYP3A4基因表达的调控作用及机制硕士研究生赵云龙导师曾昭书、杨卫红郑州大学基础医学院法医学河南郑州450001摘要背景与目的大多数药物经CYP450酶代谢。CYP酶基因的变异可导致药物不良反应,这成为影响药物安全及患者依从性的主要原因之一。CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员之一,占P450酶系总量的30%~40%,主要分布在肝脏和肠道。CYP3A4*1G(GA,rs2242480)是CYP3A4 内含子10 中的一个单核苷酸多态性(SNP),其等位基因频率在不同民族人群中存在明显差异。这个等位基因在高加索人群中少见,但在亚洲人群基因频率超过20%。体内研究表明CYP3A4*1G 基因多态性与他克莫司、阿托伐他汀、芬太尼等药物的剂量、疗效及药动学改变有关。本课题组前期用双荧光素酶报告基因技术发现在HepG2细胞中,CYP3A4 内含子10 具有受CYP3A4*1G等位基因调控的增强子与启动子活性,并发现CYP3A4*1G位点附近存在抑制性作用元件。但CYP3A4*1G及其调控的CYP3A4内含子10与CYP3A4基因表达之间的关系尚不清楚。本研究的目的是探究CYP3A4 内含子10 及CYP3A4*1G对HepG2 细胞CYP3A4 表达的影响。基因表达可由转录因子复合物调控。具有启动子和增强子活性的CYP3A4 内含子10与某些转录因子结合,进而调控CYP3A4基因的表达。因此本研究的另一目的是探讨与CYP3A4*1G及其侧翼序列相结合的转录因子,为从内含子SNP调控基因表达角度解释CYP3A4 酶活性的个体差异提供分子机制,进而为临床个体化用药和与用药相关的法医学鉴定提供理论基础。方法I构建一系列真核表达载体,转染入HepG2细胞,培养48h后,qPCR检测CYP3A4 mRNA水平,分别对其进行启动子功能分析(阴性对照组、阳性对照Ⅰ 组、野生启动子组、突变启动子组),上游增强子功能分析(阳性对照Ⅰ组、野生增强子组、突变增强子组、反向野生增强子组、反向突变增强子组),下游增强子功能分析(阳性对照Ⅱ组、下游野生增强子组、下游突变增强子组、下游反向野生增强子组、下游反向突变增强子组)。应用SPSS 21.0 对数据进行处理,采用单因素方差分析和LSD-t检验比较CYP3A4 mRNA表达的差异,检验水准α=0.05。提取HepG2细胞核蛋白,加入生物素标记CYP3A4*1G野生型及突变型探针,链霉亲和素pull-down,聚丙烯酰胺凝胶电泳后硝酸银染色,HPLC-MS/MS质谱分析CYP3A4*1G结合的蛋白。结果(1)CYP3A4内含子10启动子功能分析结果:阳性对照Ⅰ 组、野生启动子组、突变启动子组均能够有效地启动CYP3A4 基因表达。野生启动子组与阳性对照Ⅰ 组CYP3A4mRNA表达水平没有显著差异(P0.05),突变启动子组CYP3A4 mRNA表达水平显著低于阳性对照Ⅰ 组(P0.05)和野生启动子组(P0.01);(2)CYP3A4 内含子10 上游增强子功能分析结果:无论CYP3A4*1G野生型还是突变型,反向组CYP3A4 mRNA表达水平均高于正向组(P0.01);而CYP3A4 内含子10无论是正向还是反向,CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 mRNA表达水平均高于突变型组(P0.01);此外,突变增强子组CYP3A4 mRNA表达水平低于阳性对照Ⅰ 组,不但没有增强CYP3A4 启动子的功能反而有所减弱。(3)CYP3A4内含子10下游增强子功能分析结果:CYP3A4内含子10无论正向、反向、野生、突变均增强了CYP3A4启动子的活性,但该增强作用弱且不受CYP3A4*1G调控,尽管正向的增强水平高于反向,但对方向的依赖性并不十分显著。(4)CYP3A4*1G及其侧翼序列结

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