细胞生物学研究方法 2.ppt

第2章  细胞生物学研究方法 教学要求： （1）了解负染色技术冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术。 （2）掌握普通复式光学显微镜构造原理；荧光显微镜的构造原理；电子显微镜的基本构造；电子显微镜与光学显微镜的基本区别。 （3）了解用超速离心技术分离细胞器与生物大分子；显微分光光度测定技术；细胞内特异核酸序列的定位与定性；特异蛋白抗原的定位与定性；细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法；流式细胞仪。 （4）了解细胞培养与细胞工程方面的内容。 本章内容提要 1.显微技术 2.细胞的染色与标记技术 3.离心技术 4.细胞内特异核酸序列的定位与定性 5.放射自显影技术 6.细胞培养法与细胞杂交技术 第一节 细胞形态结构观察方法 （一）普通复式光学显微镜 1、组成 光学放大系统 照明系统 机械和支架系统 2. 原理：经物镜形成倒立实像， 经目镜进一步放大成 正立的虚像 普通光学显微镜.wmv 光学显微镜中的光路 光镜下酵母细胞(10μm) 2、 分辩率(resolution)： Resolution:指能清楚区分被检物体细微结构最小间隔的能力. D=0.61λ/NA NA=N sinα/2 λ为入射光线波长 N A 为镜口率＝N sinα/2 N=介质折射率 α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）  几种介质的折射率 不同光线的波长 （二）相差显微镜(phase-contrast microscope) 光波的基本属性： 波长 颜色不同 频率 振幅 亮暗不同 相位 人眼不能觉察 1.原理： 利用光的衍射和干涉现象将透过标本的相位差转换成人眼可分辨的振幅差显微镜。 提高了密度不同物质图像的明暗区别，用于观察未经染色的细胞结构。 光波的干涉现象 当两束光通过光学系统时会发生相互干涉，如果相位相同，干涉的结果是亮度增强，反之，就会相互抵消变暗。 2.相差显微镜与与普通光镜结构上的不同 a.环状光阑（condenser annulus） : 位于光源和聚光镜之间 b.相板（annular phaseplate）: 物镜后焦平面上增加了“相板”（涂有氧化镁，将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ）c.合轴望远镜: 使光路合轴 3.照到标本上的光产生的三种情况 a、一部分光穿过物体以直射光的形式通过物镜，到达相板的环形区 b、一部分光在物体发生衍射，振幅变小并偏离方向，经物镜透镜的汇聚后到达相板的其他区域,其相位落后于直射光1/4 c、一部分光穿过物体背景和物镜透射到达相板环形区 相差显微镜原理 明暗反差形成 4.应用：样品不需染色，可以观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。 相差显微镜.wmv 原理：平面偏振光为光源。光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感。 增加了样品反差和立体感。 应用：研究活细胞中较大的细 胞器。 将微分干涉显微镜接上录像机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。 （四）暗视野显微镜 (dark-field microscope) 1.原理 ： 丁达尔效应 2.暗视野显微镜与普通显微镜的区别： 聚光器 （抛物面） 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 暗视野显微镜.wmv （五）荧光显微镜(Fluorscence microscope) 1.原理 利用紫外光线为照明源，使被检物发生荧光，观察固定材料或活体材料在细胞内物质的吸收与运输，光源物质的分布与定位。 自发荧光----叶绿素、维生素A等。 诱发荧光----吖啶橙（DNA呈绿色荧光，RNA 呈橙色荧光） 荧光素：激发波长为490nm，发射波长为520nm，激发后发出黄绿色荧光 2.主要装置 a、紫外光源：高压汞灯或弧光灯 b、吸热装置：滤片 c、滤片 激发滤片 420nm紫蓝光