免疫共沉淀技术及应用.PDF

GE Healthcare Life Sciences 免疫共沉淀技术及应用 免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation,IP ） 原理： 免疫共沉淀技术(也被称为免疫共吸附 或者免疫下拉技术)能够从原始的细胞裂解物 中分离并富集目标蛋白。免疫共沉淀是利用 抗原和抗体特异性结合以及细菌的 Protein A/G 特异地结合到免疫蛋白的 Fc 片段的现象 开发出来的方法。其原理是，在细胞裂解液 中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与 抗体特异结合的结合于 sepharose beads 上的 proteinA/G ，与细胞中有目的 蛋白结合，就形成一种复合物：“目的蛋白/ 目的蛋白-抗目的蛋白抗体 -protein A/G，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫 印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与目的蛋 白天然结合，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于 检测两种目的蛋白是否在体内结合，也可用于一种特定蛋白质的新的作用 搭档。 免疫共沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实 验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免 疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验：从蛋白样品处理； 抗体-Sepharose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要 严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能达到最终的实验目的。 免疫共沉淀实验流程为： （1 ）蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞； （2 ）抗原抗体结合反应； （3 ）Protein A/G 与抗原抗体复合物结合 GE Healthcare Life Sciences （4 ）免疫复合物与 protein A/G 解离： 一般采用 2% SDS 煮沸 5 分钟处 理样品； （5 ）分析鉴定：应用SDS- PAGE，western-blotting 或质谱仪分析鉴定样 品 应用领域： 免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS和MS 质谱分 析鉴定准备样品。 Protein A Mag Sepharose、Protein G Mag Sepharose 和NHS Mag Sepharose 是设计用于简化免疫沉淀或pull-down 目标蛋白富集的磁珠。固定到Mag Sepharose 磁珠的抗体或其他蛋白用于捕获目标蛋白，之后利用磁力装置收集磁 珠。 GE 公司针对免疫沉淀的mag 产品分为以上两种，两类填料的具体实验操作 的方案也不相同： 1、常用操作填料Protein A Mag Sepharose™/Protein G Mag Sepharose，两 者对单克隆或多克隆抗体都具有高度亲和力。固定到Mag Sepharose填料的 Protein A和Protein G配体上的抗体被用于捕获与抗体结合的目的蛋白复合物，富 集目的蛋白用于质谱或电泳分析。 2、需交联操作填料NHS Mag Sepharose ： NHS Mag Sepharose被设计用于任何含有自由胺基的蛋白或其他生物分子 的共价交联，且被用于各种类型的pull-down实验。产品需要先偶联抗体或配体， 偶联后的产品再与抗体或配体结合的目的蛋白复合物结合并富集目的蛋白用于 质谱或电泳分析。 Mag Sepharose磁珠的关键优势是： 1、可见且稠密，很容易点样和收集结合的目标蛋白； 2、非粘附型磁珠消除了弥散效应和聚合物的形成，无需去污剂就可以使用； 3、目标蛋白以小或大样品体积被快速捕获(低至微升，高至毫升) 4、优化的容量用于目标蛋白的富集/免疫沉淀-只需要少量的抗体 GE Healthcare Life Sciences 5、具有可优化用于电泳和MS分析的灵活的洗脱条件步骤 另外，实验室常用的琼脂糖基质的Protein A/G 产品也可用于免疫共沉淀的 应用。一般应用protein A/G 产品免疫沉淀的实验流程如图所示。 • Proterin A/G 或NHS 磁珠 • 抗体结