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甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点 放射性标记DNA探针的制备 ?????? 聚丙烯酰胺凝胶的制备 1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。 ? ?????? DNA的标记 1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。 2．向酶切反应混合液中加入 [α－32P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基) 10μl dCTP(2mmol/L) 1μl dGTP(2mmol/L) 1μl dTTP(2mmol/L) 1μl DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl） 1μl 室温温育反应体系30分钟。 3．加入7μl 10×上样缓冲液终止反应。 ? ?????? 标记探针的分离 1．将反应混合物上样于非变性凝胶。 2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。 3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。 4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。 5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm2）后，放入微量离心管中。 6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。 7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。 8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。 9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约104cpm/μl。 甲基化反应 1．室温下，于微量离心管中建立如下列反应（每一DNA片段需6个离心管，3个用于起始反应，3个用于终止反应） ?管1 C反应管2 为结合的G反应管3 A＋G反应起始反应液???DMS缓冲液200μl200μl－H2O－－18μl载体DNA1μl1μl1μlDNA探针1μl10μl2μl? ?管4 C终止管5 G终止管6 A＋G终止终止反应液???DMS终止液50μl50μl－醋酸钠（0.3mol/L; pH7.0）－－200μl乙醇（100％，冰预冷）1mol1mol1mol? 2．在1号和2号管中加1μl DMS，并加3μl 10％甲酸于3号管中起始反应。 3．将1号和2号管在16℃下放足4分钟，3号管在37℃温育15分钟。加入适量终止液终止反应。 4．剧烈振荡离心管并置于干冰/乙醇浴6分钟。 5．4℃离心7分钟。 6．用长巴斯德吸管弃上清，用1ml 100％乙醇清洗沉淀。 7．室温下离心3分钟。 8．弃去上清。 9．用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀，2号管的DNA沉淀用于结合反应，1号及3号管保存于－20℃备用。 蛋白/DNA结合反应 ?????? 聚丙烯酰胺凝胶的制备 灌制5％非变性聚丙稀酰胺凝胶，用10×TGE配制TGE终浓度为1×的凝胶。 ? ?????? 结合反应 1．用23μl H2O溶解已干燥、甲基化的、标记的DNA沉淀（2号管）。 2．加入： poly(dI-dC)?poly(dI-dC)(1μg/μl) 2μl 蛋白提取液 10～20μl 结合缓冲液（10×） 5μl 加水至终体积为50μl 3．室温下，进行30分钟的结合反应。 4．加3μl上样缓冲液到样品中并上样5％非变性聚丙酰胺凝胶。 5．在1×TGE 10V/cm下电泳2～3小时，分离游离的和与蛋白结合的D