白花蛇舌草提取物对结肠癌HT-29细胞Bcl-2和Bax表达影响.docVIP

白花蛇舌草提取物对结肠癌HT-29细胞Bcl-2和Bax表达的影响 　　 结直肠癌(CRC)是危害人类健康的主要肿瘤之一,在美国的各种肿瘤中位列第三[1]。最新统计数据显示2007年估计在15多万CRC的新病例中就有5万多人死于CRC[1,2]。虽然一直以来欧美发达国家是结肠癌的高发地区,但近些年来随着经济的发展,人们的生活方式特别是饮食结构的改变,我国结肠癌发病率也呈逐年上升趋势,严重威胁着国人的生命和健康[3]。近年来随着对结肠癌认识的加深,在治疗方面有了较大的发展,但是至今尚未发现有效的药物治疗手段。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草[hedyotis diffusa Willd.[Oldenlandia diffusa (Willd.) Roxb.]的全草,始载于《广西植物志》,味苦、淡,性寒,无毒,归胃、大肠、小肠经。其主要功效是清热解毒、消痛散结、利尿除湿,广泛用于治疗各种炎症和肿瘤。但白花蛇舌草的抗肿瘤分子作用机制尚未完全阐明,并根据白花蛇舌草中医的归大肠经??论,故就白花蛇舌草对人结肠癌HT-29细胞凋亡关键调控蛋白Bcl-2/Bax表达的影响进行研究。 　　1材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1药物的制备 　　 白花蛇舌草购自福建中医药大学国医堂医院,批号白花蛇舌草全草,用10倍85%乙醇回流提取2次,合并后过滤,回收乙醇,滤液浓缩至相对密度1.05,经喷雾干燥得粉末。得到得提取物用40%DMSO溶解,配制成0.4g/mL溶液,经高压灭菌后于4℃保存待用。 　　1.1.2细胞株 　　 结肠癌细胞株(HT-29),中南大学湘雅中心实验室。 　　1.1.3试剂 　　 RPMI1640培养基、胰蛋白酶(trypsin),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),Hyclone公司;四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)干粉,Sigma公司;RT试剂盒、Trizol、PCR试剂盒,Promega公司;Taq聚合酶、Rnase inhibitor,TaKaRa公司;引物由上海英俊生物有限公司合成。 　　1.1.4仪器 　　 RE-2000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;DLSB-5/20低温冷却循环泵,郑州长城科工贸有限公司;B-290型实验室小型喷雾干燥机,瑞士Buchi公司;ELX800酶标仪,BioTek公司;HF212UV二氧化碳培养箱,Heal Force;IX70荧光倒置相差显微镜,日本OLYMPUS;GST-1型PCR仪,英国GSTORM公司;Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统、APC 300型电泳仪,美国Bio-Rad公司;DU-650型蛋白核酸分析仪,,美国Beckman公司;5417R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1细胞培养 　　 将人结肠癌细胞株HT-29置于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。 　　1.2.2MTT法检测细胞活性 　　 取对数生长期的人结肠癌细胞HT-29,用0.25%胰酶消化并收集细胞。以RPMI1640培养液(含10%FBS)制成细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔培养板中,每孔100uL,常规培养24h,使细胞同步化。细胞分为4组,白花蛇舌草给药浓度分别为0mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL,以上各组均设8个复孔。继续培养24h,吸弃各孔中的液体,每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液100uL,37℃孵育4h,然后吸弃各孔中的液体,加入DMSO 100uL/孔,振荡混匀,室温放置10min,使结晶充分溶解并混匀,于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值(即A值),并按下列公式计算增殖抑制率:抑制率(%)=(对照组A值一实验组A值)/对照组A值×100%。 　　1.2.3细胞形态学观察 　　 HT-29细胞用白花蛇舌草提取物培养24h后,在倒置显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。 　　1.2.4RT-PCR检测Bc1-2和Bax mRNA表达 　　 对数生长期的HT-29细胞胰酶消化后,取2×105个细胞/孔,接种于6孔板,24h后进行药物干预,继续培养24h后,用Trizol法提取总RNA,逆转录为cDNA。取上述细胞提取总的RNA,总RNA的提取参照Trizol试剂(Invitrigen公司)说明书进行操作。取总RNA 1micro;g,应用逆转录(RT)试剂盒进行逆转录反应。PCR反应体系(20μl体系):cDNA 1μl,10×Taq Buffer 2ul,2