肠道病毒71型(EV71)感染性克隆构建.docVIP

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建 　　 肠道病毒71是小RNA病毒科肠道病毒属中的一员,常在婴幼儿中引起手足口病的大范围爆发流行,并能导致重症、甚至死亡病例的发生。1998年中国台湾地区129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起[1],2008年和2009年以EV71感染为主引起的手足口病在中国大陆多个省市流行,并导致479名儿童死亡[2]。这些手足口病疫情使越来越多的研究针对EV71致病机制、病毒变异与毒力以及疫苗开发。 　　 反向遗传技术为在DNA水平上对RNA病毒进行研究和操作提供了极为方便有用的工具。本研究构建了EV71全长cDNA克隆,并将体外转录得到的RNA转染RD细胞,成功获得拯救病毒,为进一步研究EV71病毒基因功能、基因变异与病毒毒力关系、基因疫苗等研究以及防控该病奠定良好的基础。 　　1材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1毒株与细胞 　　 EV71病毒株FJ08149是2008年从一手足口病病例疱疹液分离获得,经鉴定为EV71 C4基因亚型。RD细胞由中国疾病预防控制中心脊灰实验室惠赠。 　　1.1.2主要试剂 　　 长片段扩增Primescript RT-PCR Kit购自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA载体 购自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 购自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 购自Qiagen公司;EV71单克隆抗体购自Chemicon公司;FITC标记的二抗购自Dako公司。 　　1.2 引物设计与合成 　　 根据FJ08149株的序列和酶切位点,设计了一对引物,上游引物 EV71-5T7在其5引入T7启动子序列及NotI酶切位点,下游引物EV71-3RM在其5端引入52个Poly(T)及MluI酶切位点。由Takara公司合成。 　　1.3 RT-PCR扩增基因片段 　　 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂说明提取病毒RNA,最后用适量无RNA酶的双蒸水溶解。根据长片段Primescript RT-PCR Kit说明书,先以EV71-3RM为反转录引物,在42℃反应1小时反转录全长cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS进行基因组全长扩增,PCR反应条件为:95℃预变性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40个循环;72℃ 10min。反应产物在0.7%琼脂糖中电泳进行检验。 　　1.4 全长cDNA 的构建与鉴定 　　 RT-PCR扩增产物经电泳后纯化,以TA克隆方法将带有T7启动子识别序列的基因组全长连入TOPO-XL-PCR载体中,用MluI和NotI酶切鉴定是否插入目的片段。 　　1.5 体外转录与转染RD细胞 　　 用MluⅠ和NotI将有目的片段插入的质粒进行双酶切线性化,纯化后按照T7体外转录试剂盒说明在体外转录出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)试剂盒进行RNA纯化后,加30ul无RNA酶的双蒸水洗脱, 定量。按照Transfection reagent说明书要求把RNA转染到培养于6孔细胞板RD细胞中, RNA含量为2μg/孔。转染后每天观察细胞,待细胞病变(CPE)达到75%及以上或观察7天后,收获细胞进行鉴定与传代。 　　1.6 拯救病毒的鉴定 　　1.6.1 RT-PCR鉴定及VP1序列测定 　　 用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)诊断引物对拯救病毒进行鉴定。应用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT 　　TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)扩增包括VP1全长在内的1082bp产物,并进行序列测定分析。 　　1.6.2间接免疫荧光试验鉴定 　　 CPE达到75%及以上或观察7天后,收集细胞及上清,2500rpm离心10min,取细胞沉淀用无菌PBS洗2次后,重悬细胞沉淀,滴加到荧光片,用丙酮将其固定,蒸镏水清洗1次后加入EV71单克隆抗体,37℃湿盒中孵育1 h,PBS 洗涤3次。加入用1∶6000伊文斯兰以1∶40 稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗,37℃湿盒中孵育1h,PBS洗涤3 次后甘油封孔,镜检。 　　1.6.3拯救病毒效价测定 　　 获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后,与母本病毒同时进行TCID50测定。详细方法及步骤参见