性别控制研究.pptVIP

性别决定、鉴定、控制 性别决定 1899年，Cuenot否定性别由妊娠条件决定，确立遗传物质决定性别学说 1902年，McChung提出性别决定染色体理论 1905年，Stevens和Wilson定义X和Y染色体 20世纪50年代，确定性别决定的两个法则：（1）性腺特化为睾丸或卵巢决定胚胎性分化；（2)决定雄性性别的因子存在于Y染色体上。 性别决定的两个重要发现 H-Y抗原（male specific minorhistocompatibility-Y antigen，雄性特异性弱组织相容性抗原）：1975年，Wachtel等提出H-Y抗原是主要的睾丸诱导物的假说。H-Y抗原是存在于雄性哺乳动物细胞膜上的一种糖蛋白。但H-Y抗原表达与睾丸发育不总具有相关性，并不决定睾丸分化。 SRY（sex determining region of Y-chromosome，Y染色体性别决定区）：1987年，Page发现睾丸决定因子（testis determining factor，TDF）存在于Y染色体短臂接近假长染色体的区域。1990年，Sinclair等研究人、牛、小鼠时，确定距假常染色体边缘5kb处的一个片段为SRY。同时，Gubby等在小鼠中发现类似同源系列，称为Sry。SRY就是人们长期探索的雄性基因。 生殖器官个体发育的特点 与泌尿器官的发生和结构上有密切关系 幼胚生殖腺是两性的 均有两套生殖管道（一对中肾管Mesonephric canal 即 WOLFFIAN DUCT 、一对副中肾管Paramesonephric canal 即 MULLERIAN DUCT ） 性分化后的个体，只有一套生殖管道发育 胚胎性别鉴定 核型分析：显微镜检查囊胚细胞核型，寻找与X性染色体不配对的Y染色体。处理时间长，准确率差异大，胚胎损伤大。 测定X染色体相关的酶活性：与X染色体相关连酶（如次黄嘌呤磷的细胞内浓度及活性是雄性胚的两倍（但可能因1条雌性染色体失活造成误判），可用于胚胎早期检测。 检测H-Y抗原：用雄鼠脾脏匀浆制造H-Y抗血清或单克隆抗体，检测效价,与桑椹胚共培养，继续发育为有腔囊胚者为雌性胚胎，发育抑制者为雄性胚胎。雄性胚胎洗脱抗血清后仍可继续发育。抗血清还可连上带有荧光素的二抗，，发荧光的胚胎为雄性胚胎。本法具有一定准确性，对胚胎损伤小。 分子生物学方法（检测SRY） PCR方法：引物设计、胚胎取样（5-8个胚胎细胞）、扩增、电泳、染色显带。时间2-2.5h，准确率95%，胚胎损失不大 LAMP法：针对目标基因的6个区段设计4对引物，链置换反应，可利用浊度仪一步完成扩增、检出、判定，时间40min。简便、快速、准确，但仪器和试剂盒较贵。 核酸探针法：将胚胎细胞DNA与Y染色体特异标记的DNA序列（探针）杂交，阳性者为雄性。灵敏度低、耗时长。 性别控制：XY精子分离 物理方法 沉降法 密度梯度离心法 凝胶过滤法 电泳法 分离结果不确实，纯度低、精子受损伤 免疫学方法（免疫磁力选择法）：将洗过的精子用H-Y抗原的单克隆抗体处理，再加入包裹超磁化多聚体小珠的二抗，利用磁体可将与磁珠相连的精子从样品中去除。此法分离纯度高、效率低。 流式细胞仪精子分离法 1981年用流式细胞仪测精子DNA 1989年分离活精子成功，得到性控兔后代 1989-1998年实验应用 2000年英国Cogent公司进入商业化生产（有10台仪器，日产量1080支） 世界上少数几个国家拥有不足20台仪器 中国几家公司正在积极引进，目前规模：天津12台，内蒙2台 原 理 X精子比Y精子DNA含量多3%-4%（猪3.5%、牛3.9%、羊4.2%） 采用无毒荧光染料（HOECHST 33342）对精子染色 流式细胞仪中氩离子紫外激光激发荧光染料，产生蓝色激发光（X精子荧光强） 仪器喷嘴高频震动，使喷出液体形成一滴滴带单个精子的液滴 荧光信号通过光电倍增管转变为电信号，经仪器信息处理，使液滴中单个X和Y精子分别带上负、正电荷 液滴通过高压电场，带有不同电荷的X、Y精子分别落入不同的收容器中。 分离效率 仪器喷射液体速率每秒90000滴 每秒精子收集总速率20000滴（微滴中含多个精子不能被识别，只有被识别的精子才能施加电荷） 每秒钟收集活的X、Y精子3000-5000个 每小时可得到1000-1400万个X精子 每天可生产100-150支细管X精液（每支精子数200万） 分离正确率约90% 人工授精青年母牛受孕率50% 存在问题 分离效率低（4万/年、台），每支细管精子数少（200万/支）、成本高（50美元或350-400元/支） 一般冷冻精液每