enterobacter aerogenes sp. gxe3组氨酸脱羧酶hdc1基因的克隆及功能特征分析word格式论文.docx

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2018-05-18 发布于上海
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enterobacter aerogenes sp. gxe3组氨酸脱羧酶hdc1基因的克隆及功能特征分析word格式论文

将重组表达质粒导入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，0.05%的L-组氨酸和IPTG可诱导重组hdc1 基因表达。利用Ni 柱亲和层析技术完成了重组表达蛋白的纯化。研究发现重组Hdc1蛋白最适pH为6.5；最适温度为25℃；该酶在30℃以下时性质稳定，相对剩余酶活达85%以上；Hdc1在pH7.0-8.0 之间酶活力较为稳定；Mg2+和Fe3+对Hdc1酶活有极大的抑制作用；该酶的比活力为2.38U/mg，Km值为2.047mM，Vmax值为0.639μg/min，kcat值为13.155/s。产气肠杆菌GXE3的培养酶液中，HDC蛋白的最适pH为6.0；最适温度为30℃；该酶在30℃以下，pH5.0-7.0时性质稳定；Zn2+和Ca2+ 对酶活力有轻微的激活作用；该酶的比活力为3.33 U/mg，Km值为1.461 mM，Vmax值为0.428μg/min。本研究完成了产气肠杆菌组氨酸脱羧酶的生化功能研究，有助于了解在发酵食品和水产品中组胺产生和积累的影响因素，为相应的食品安全卫生提供了检测数据参考。关键词：组胺组氨酸脱羧酶产气肠杆菌比活力功能鉴定GENECLONINGANDFUNCTIONALCHARACTERISTICSOFAL-HISTIDINEDECARBOXYLASEHDC1FROMENTEROBACTERAEROGENESSP.GXE3ABSTRACTBiogenicamineisakindofbiologicalfactorwhichcloselyrelatedtofood safetyandhumanhealth.Generally,histamineexistinginmeat,dairyand fermentedproducts,whichproducedbymicroorganism,istoxictohumanrace. Sofar,theresearchofhistamine-producingbacteriaaroundtheworldfocuson detectionmethod,identificationof bacterialandanalysisoffeature.Butresearch inrelatedsynthesisenzymeisless.TheauthorgotsomestrainswhichproducedL-histidinedecarboxylasefromenvironmentbaseonfunctionalseparation screeningstrategy,thosestrainstobeprovedashistamine-producingbacteria afterstudyingbymicrobiology,molecularbiologyandchemicalmethods. Amongthosestrains,fourofthemwereEnterobacteraerogenesandoneof themwasKlebsiellaafteranalyzingthemorphologicalcharacteristics, physiologicalandbiochemicalfeaturesand16S rDNAsequence.As the object of E. aerogenes sp. GXE3 in this study, primers weredesignedaccordingtotheE.aerogenesHDCgenesequencereportedin Genbank,withtheDNAofgenomewasextracted,thenamplifiedbyPCRand clonedtheHDCgeneintopET-30a(+),afterthattransferreditintoEscherichis coliDH5αtoconstructrecombinantclone.Bio-informaticsanalysisshowedthat therecombinantplasmidcomprisingaORFof1137basepairs,whichencodeda proteincontaineda378aminoacidwithmolecularmassof42.4kDa,thegene wasnamedhdc1.Attheaminoacidlevel,TheHdc1proteinsharedthehighest identical100%withL-histidinedecarboxylasefromE.aerogenesKCTC 2190(GenBankaccessionnumber:YP_004590726