凝集素芯片使用说明.docVIP

材料目录 芯片凝集素点阵 凝集素芯片保存方法 凝集素芯片使用方法 所需试剂及其配置方法 凝集素亲和性表 一 芯片上各个凝集素点阵 □ AAL BPL DSL DBA ECL AAL BPL DSL DBA ECL ? EEL HHL Jacalin LTL MAL Π EEL HHL Jacalin LTL MAL Π ? MPL NPL WBA EBL STL MPL NPL WBA EBL STL ? SBA UEA WGA SWGA WFL SBA UEA WGA SWGA WFL ? ? ? ? ? 说明：1、□是荧光位置标记位点，作为坐标 2、每个凝集素重复两个点。 二、凝集素芯片保存方法 将凝集素芯片放在芯片盒内（注意不要互相接触），放入4℃冰箱冷藏，可保持3-6个月。 三、凝集素芯片使用方法 （一） 对细胞的检测 细胞系细胞提取 取对数生长期的细胞,倾去培养液，加入0.25％胶原酶Ⅳ（D-hanks），37 ℃消化1 h，每隔10 min吹打一次。1500r/min离心5 min，收集沉淀。PBS洗涤2次，重悬备用（注：用胶原酶主要是怕损伤细胞膜糖链结构，如果没有，常规细胞培养的胰蛋白酶也可） 如果对细胞进行荧光标记，在重悬后的细胞液中加入50-100ul的吖啶橙溶液，轻摇5min后PBS洗涤两次，重悬备用。 体液细胞悬液的制备 胸腔积液、腹水等1500r/min离心5min后，倾倒上清液。按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞，轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min，收集沉淀。PBS洗涤2次，重悬后进行细胞计数（1×104—1×106）。取少许上述细胞悬液，孵育到凝集素芯片上（如需荧光标记，重复上面荧光标记步骤）。 组织细胞提取 取动物组织，用肝素D-hanks液清洗后剪碎，0.25％胶原酶Ⅳ（D-hanks），37℃消化1h，每隔10min吹打一次。1500r/min离心5min，按1:3的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液去除红细胞，轻轻吹打混匀。1500 r/min离心5 min，收集沉淀。RPMI 1640洗涤2次，重悬备用。 凝集素芯片孵育 取出备用的凝集素芯片，于37℃湿盒内水化30 min，0.5％酪蛋白溶液（PB，0.01 mol/L， PH=7.2）封闭5 min，PB缓冲液（0.01mol/L，pH=7.2）洗涤15 min，将细胞悬液滴加到芯片上，覆盖住凝集素芯片矩阵，常温或者37 ℃孵育40 min，PBS缓冲液（pH 7.2）洗涤，3%戊二醛（PBS，pH 7.2）固定2 min（如不染色，固定一步可以省略）。 凝集素芯片捕获细胞的检测 荧光标记的检测 激光扫描仪扫描整个芯片 常规P巴氏染色（Papanicolaou’s stain），观察捕获细胞位点，显微镜下观察（注：PE染色后吖啶橙荧光消失）。 对蛋白的检测 芯片准备处理同前 检测方法 蛋白直接荧光标记，扫描检测 蛋白捕获后，加荧光二抗孵育，扫描检测 蛋白孵育后，加其他标记的二抗检测。 四、所需实际配置方法 1、凝集素芯片封闭液 0.5%酪蛋白溶解到PH=7.4的PB溶液里（0.01M），溶解过程需要煮沸加热，分装冻存。 2、吖啶橙染色液 0.05%吖啶橙PBS溶液。 五 芯片所用凝集素亲和性 凝集素 来源 糖链特异性 DSL Datura stramonium (GlcNAc)n, polyLacNAc and LacNAc (NA3, NA4) MPL Maclura pomifera Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) and GalNAcα-Thr/Ser (Tn) WBA Psophocarpus tetragonolobus α-GalNAc and Gal Jacalin Artocarpus integrifolia Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) and GalNAcα-Thr/Ser (Tn) LTL Lotus tetragonolobus Fucα1-3GlcNAc, Sia-Lex and Lex SBA Glycine max Terminal GalNAc (especially GalNAcα1-3Gal) BPL Bauhinia purpurea alba Galβ1-3GalNAc and NA3, NA4 WFL Wi