第5章 目的基因的获得.pptVIP

第一部分 目的基因 什么是目的基因 目的基因的作用 如何得到目的基因 中心法则 DNA→RNA→蛋白质 结构基因的基本组成 转录启动区 核糖体识别区 编码区 转录终止区 1 原核生物基因的组成 启动区 SD区 基因编码区 转录终止子和终止因子 1.1 基因编码区 多数以操纵子形式存在，同类功能基因聚集 同一个启动子 同一个终止子 各基因分别有起译码ATG和终止码TAA 基因间存在间隔序列，也有例外 1.2 核糖体结合位点（SD序列） mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始，因此也称为核糖体结合位点。 1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD序列 核糖体结合位点（SD序列） mRNA上 起始密码子ATG上游约10bp处的序列区 富含嘌呤 保守序列为5’AGGAGG3’ 与核糖体小亚基的16S rRNA识别、结合 SD序列以及SD序列与起始密码子AUG之间的距离决定翻译效率 1.3 启动子 原核生物的启动子 原核生物的核心启动子 2 真核生物基因的组成 基因区 转录启动区 转录终止子 真核生物基因的基本结构 2.1基因区 一般单独存在 基因间存在非编码间隔区 基因内部存在内含子 一个基因只有一个起始密码子和终止密码子 2.2 真核生物的启动子 真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。 RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。 RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂； RNA聚合酶III转录tRNA和5S rRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称为下游启动子。 真核生物的RNA聚合酶 RNA聚合酶II的启动子 Cap site：initiation point (+1) ，即转录起始位点，多数情况下为A，两边多是嘧啶。在转录出20～30nt时，转录体5’端会连接上N7-甲基鸟苷酸（m7G），结果就成了 Capping m7GpppA/G------70 ±---AUG---(in mRNA) RNA聚合酶II的启动子 2.3 转录终止子 转录产物在3’端被切断 3’端进行多聚腺苷酸化，形成polyA尾巴 无终止作用 3’切割及poly（A） 在Poly(A)加尾之前，3’端通常要进行切割。 mRNA3’端加入polyA的过程称为3’端多聚腺苷酸化（polyadenylation）。多聚A尾通常长度在20-200nt之间。 切割信号有两个，一个是AAUAAA序列。切割位点主要在这个特异性序列下游约10-35nt。另一个切割信号位于切割位点下游约50nt，这个序列（ GUGUGUG ）通常富含U或GU。 3’切割及poly（A） 切割因子（cleavage factor）切割RNA产生3’末端； 腺苷酸聚合酶在3’末端聚合A； poly(A)结合蛋白结合到poly(A)上，形成复合物； 复合物在聚合了约200nt的A之后从RNA上释放。 第二部分 目的基因的获得 直接分离法 PCR扩增 构建基因组文库法 构建cDNA文库法 化学合成法 第一节 直接分离法 限制酶酶切法 DNA分子已测序，利用已知的限制酶进行切割 分离纯化所需的DNA片段 重组转化 目的基因已定位，根据目的基因两侧的识别序列，采用已知的限制酶切割 分离纯化 重组转化 第二节 基因组文库的构建 DNA未测序或未定位 采用限制酶切割 构建基因组文库 筛选目的基因克隆 基因组文库 某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。 P104 基因组文库的特点 构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。 基因组文库的大小 一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有DNA序列 载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 理论公式：克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长 常用载体的容量 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片段长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。 ①酶切法： 内切酶Sau3A进行部分酶切。可得到10-30kb的随机片段。 ②物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 （2）载体与基因组DNA