16SrRNA基因测序技术的比较1.PDF

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16SrRNA基因测序技术的比较1

White Paper ® 微生物鉴定:Axiom Microbiome Array 技术与 16S rRNA 基因测序技术的比较 摘要 过去十多年来,大规模并行的高通量、短读长16S核糖体RNA (rRNA)基因测序已经取代了传统的长读长Sanger 测序, 用于群落中细菌的鉴定。1 这种基于新一代的靶向扩增子方法的转变,为微生物样品的分析提供了一种更高效、更经 济的方法;然而,这种方法是以牺牲分类分辨率为代价的,仅限于通过保守的16S rRNA 基因引物来检测细菌,而这 些细菌与微生物群落中的其他成员(如真菌、病毒和原生动物)是没有同源性的。尽管全基因组的宏基因组测序等其 他方法也被用于分析微生物群落,但这些方法需要更高的Reads 深度,才能准确地推断分类的起源,就每个样品而 言成本太高。在此,我们提出一种新颖的微生物分析方法,它基于Affymetrix 的Axiom® 基因分型平台,可在单个 反应中实现对一个样品里所有生物体――包括细菌、病毒、原生动物、真菌和古细菌的检测,分辨率达到菌种甚至常 ® 常达到菌株水平。我们认为,Axiom Microbiome Array 可实现更高的准确性和分辨率,并采用了简化的操作流程 和简单的分析软件。 结果 ® ® Axiom Microbiome Array 是为分析生物界或生物域中的微生物个体而设计的。Axiom Microbiome Array 利用 ® Axiom 2.0 assay 的技术,其中包括全基因组等温扩增(WGA)的步骤。从微生物中提取出的DNA 作为起始材 料,直接用于流程的第一步。为了获得由RNA 组成的病毒基因组的子集数据,提取出的RNA 被逆转录,而产生的 ® ® cDNA 可作为Axiom assay 流程的模板。Axiom Microbiome Array 的数据是通过一个名为Axiom™ Microbial Detection Analysis Software (MiDAS)的软件界面来分析的。这个软件利用Lawrence Livermore 国家实验室开 2,3 发的Composite Likelihood Maximization (CLiMax)算法。 Axiom™ MiDAS 针对芯片上也存在的非基因组, 非目标探针的信号、在非目标探针的第99 百分位的探针强度设立阈值,将探针水平的杂交强度转化成双态模型(开 / 关)。算法随后利用这一信息来建立样品的预测模型,以便最佳地解释探针水平的数据。这种迭代的“Greedy”算 法过程将目标加入样品的描述中,最终以所检测生物体的列表为结束。之后执行按经验确定的过滤参数,基于条件对 数似然值除以初始对数似然值的比值,进一步细化初始的检测目标列表。建议使用0.2 的阈值,以便去除对预测模型 贡献最小的目标。Axiom™ MiDAS 在下面所述的研究中产生结果,都使用了这一最终的阈值。 与16S 和18S rRNA PCR 方法特异针对细菌或真菌不同,全基因组扩增(WGA)步骤并非特异性扩增微生物的目标 DNA。因此,样品中存在的宿主基因组DNA (gDNA)将与微生物DNA 一起扩增,因为不存在微生物特异的富集。 ® ® 为了评估Axiom Microbiome Array 的检测极限(LOD),我们选择了三种细菌基因组,作为Axiom 2.0 assay 目标制备的起始样本,同时起始量在1 至100 万个基因组当量(图1)。我们选择的细菌基因组代表了不同的科, 覆盖各种基因组大小和GC 含量(蜡样芽胞杆菌:5.4 Mb,35% GC ;海栖热袍菌:1.9 Mb,46% GC ;伯克氏菌 ® Burkholderia thailandensis :6.7 Mb,67% GC),以控制任何可能对Axiom 2.0 assay 技术产生影响的因素。检 测的灵敏度

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