16SrRNA基因测序技术的比较1.PDF

White Paper ® 微生物鉴定：Axiom Microbiome Array 技术与 16S rRNA 基因测序技术的比较 摘要 过去十多年来，大规模并行的高通量、短读长16S核糖体RNA （rRNA）基因测序已经取代了传统的长读长Sanger 测序， 用于群落中细菌的鉴定。1 这种基于新一代的靶向扩增子方法的转变，为微生物样品的分析提供了一种更高效、更经 济的方法；然而，这种方法是以牺牲分类分辨率为代价的，仅限于通过保守的16S rRNA 基因引物来检测细菌，而这 些细菌与微生物群落中的其他成员（如真菌、病毒和原生动物）是没有同源性的。尽管全基因组的宏基因组测序等其 他方法也被用于分析微生物群落，但这些方法需要更高的Reads 深度，才能准确地推断分类的起源，就每个样品而 言成本太高。在此，我们提出一种新颖的微生物分析方法，它基于Affymetrix 的Axiom® 基因分型平台，可在单个 反应中实现对一个样品里所有生物体――包括细菌、病毒、原生动物、真菌和古细菌的检测，分辨率达到菌种甚至常 ® 常达到菌株水平。我们认为，Axiom Microbiome Array 可实现更高的准确性和分辨率，并采用了简化的操作流程 和简单的分析软件。 结果 ® ® Axiom Microbiome Array 是为分析生物界或生物域中的微生物个体而设计的。Axiom Microbiome Array 利用 ® Axiom 2.0 assay 的技术，其中包括全基因组等温扩增（WGA）的步骤。从微生物中提取出的DNA 作为起始材 料，直接用于流程的第一步。为了获得由RNA 组成的病毒基因组的子集数据，提取出的RNA 被逆转录，而产生的 ® ® cDNA 可作为Axiom assay 流程的模板。Axiom Microbiome Array 的数据是通过一个名为Axiom™ Microbial Detection Analysis Software （MiDAS）的软件界面来分析的。这个软件利用Lawrence Livermore 国家实验室开 2,3 发的Composite Likelihood Maximization （CLiMax）算法。 Axiom™ MiDAS 针对芯片上也存在的非基因组， 非目标探针的信号、在非目标探针的第99 百分位的探针强度设立阈值，将探针水平的杂交强度转化成双态模型（开 / 关）。算法随后利用这一信息来建立样品的预测模型，以便最佳地解释探针水平的数据。这种迭代的“Greedy”算 法过程将目标加入样品的描述中，最终以所检测生物体的列表为结束。之后执行按经验确定的过滤参数，基于条件对 数似然值除以初始对数似然值的比值，进一步细化初始的检测目标列表。建议使用0.2 的阈值，以便去除对预测模型 贡献最小的目标。Axiom™ MiDAS 在下面所述的研究中产生结果，都使用了这一最终的阈值。 与16S 和18S rRNA PCR 方法特异针对细菌或真菌不同，全基因组扩增（WGA）步骤并非特异性扩增微生物的目标 DNA。因此，样品中存在的宿主基因组DNA （gDNA）将与微生物DNA 一起扩增，因为不存在微生物特异的富集。 ® ® 为了评估Axiom Microbiome Array 的检测极限（LOD），我们选择了三种细菌基因组，作为Axiom 2.0 assay 目标制备的起始样本，同时起始量在1 至100 万个基因组当量（图1）。我们选择的细菌基因组代表了不同的科， 覆盖各种基因组大小和GC 含量（蜡样芽胞杆菌：5.4 Mb，35% GC ；海栖热袍菌：1.9 Mb，46% GC ；伯克氏菌 ® Burkholderia thailandensis ：6.7 Mb，67% GC），以控制任何可能对Axiom 2.0 assay 技术产生影响的因素。检 测的灵敏度