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细胞培养技术总结课 细胞培养基本技术回顾 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗 玻璃器皿的清洗 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不残留任何物质 浸泡：清水浸泡，可使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，生产及运输中，玻璃表面带有大量干固的灰尘，表面呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 先用自来水刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜以中和碱性物质 再次使用的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有气泡或浮在液面上 刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 浸酸 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质； 浸泡时器皿要充满清洁液； 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时。 清洁液，常用三种：强清洁液，次强清洗液，弱清洁液 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满荡洗后倒净，最后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用 胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗 2 - 3次，晾干备用 塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用 消 毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于在培养过程中每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它方法进行消毒的培养器皿，30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min 干烤：160℃, 2 小时 过滤：0.22μm 化学消毒灭菌法 70%酒精：操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面处理； 1‰新洁尔灭：器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 培养用液灭菌或预防培养物污染 细胞培养常用试剂 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水  二、细胞培养基 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等 细胞培养基应用选择 选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 制备1000 ml DMEM培养基 DMEM?干粉培养基 10.0 g（1包）及要求的NaHCO3量（3.7g） 加入细胞培养用水?600 ml ↓　 磁力搅拌至完全溶解? ↓　 加细胞培养用水定容至 1000 ml ↓在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22 ?m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成 100-200 ml/瓶，4℃保存备用。同时取少量做无菌实验。 ↓ 使用前添加小牛血清至终浓度为10%，添加青霉素和链霉素至终浓度分别为100 U/ml和100 ?g/ml，即为细胞培养用液。 血清 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。 适用于细胞因子和免疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处