实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结培训课件方案研究.pptVIP

目前实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结;几种细胞实验步骤;人脐带纵剖面和直观图;实验操作步骤;打开NS. ，点燃酒精灯（不建议使用），将酒精棉铺开在操作台中央，方便将所有器械和瓶盖的摆放。; 3 将半月盘内倒入少许无菌NS.,取出新鲜脐带轻轻放入半月盘内，用灭菌后的脱脂棉球将脐带外周的血迹擦干，将脐带两端血迹擦干以便暴露静脉血管。将圆头不锈钢针头轻缓的插入两端静脉血管内，并顺势用止血钳夹死固定。注意：本实验操作时要戴好橡胶手套，操作前进行医用酒精擦拭消毒，当脐带过短时，只要一端插入圆头针，另一端用止血钳夹死。 ;用无菌NS.,将脐带静脉血管内的淤血冲洗干净，直到冲出的NS.无色为止，接着将血管内的空气抽空，两端固定。;5 将Ⅱ型胶原酶注入脐带静脉血管内，此步骤操作时，注意两端的注射器要来回做活塞运动以便使血管内壁与Ⅱ型胶原酶充分接触，注入的Ⅱ型胶原酶比例为8ml/15cm。注意：一般本步消化时间为10分钟左右， Ⅱ型胶原酶的温度保证在37℃左右消化能力最好。特别提醒的是在消化过程中要用手来回揉搓脐带外壁，有助于内皮细胞的脱落，此细节至关重要，决定了实验成败 ;此细节至关重要;终止消化，将静脉内含有EC细胞的消化液注入含有小牛血清的离心液里终止消化，两者比例为1:1，并用离心液冲洗静脉血管两次，并将收集的细胞悬液装入离心管，封口 离心，将离心管放入离心机，设定离心速度和时间。一般1200r/min,8分钟。 待离心机完全停稳后，打开，取出离心管。小心取放，避免震动幅度过大，倒去上清液，将贴壁细胞用新鲜的培养基全液吹打垂悬，放入细胞培养瓶（一般5ml/瓶） ;9 37℃,5%，CO2孵箱培养，第二天换液，去除未贴壁细胞，继续培养。待细胞几乎铺满瓶底时传代约为3/4。;二 SMC的原代培养;SMC 细胞来源;实验操作步骤;观察脐带纵面，找到脐带内两根动脉，从中间小心剪一豁口。用组织剪牵拉两部分，直至分离出动脉血管。 将剖离的动脉转移到一干净的6孔板内,孔内加入少许NS.;剥离血管外膜，小心用一眼科直镊夹住血管一端，用另一把弯镊轻轻向下牵拉血管外壁，直到明显可见一层???组织与内层组织分离。此时应夹紧该层组织，迅速向下剥离。 注意：此步骤最为关键，直接决定细胞组织的增殖活力 7 将剩下的血管组织再次转移到另一孔内，孔内加入少许NS.,用弯镊夹住血管一端轻轻地套在眼科剪前端，渐次将组织依次剪开，用一灭菌脱脂棉轻轻擦拭血管内壁，除去血管内皮细胞;8 将血管中层再次转移到一孔内,孔内加入少许培养基，用眼科剪（直）将组织尽数剪成1mm×1mm的小组织块;将剪好的组织块用一弯头吸管吸出来放进细胞培养瓶内，小心将培养基吸出来，将组织块轻轻地均匀的贴在细胞瓶底。 加入新鲜的培养基，小心不要将瓶底的组织块冲刷掉。 将细胞培养瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培养 注意：此时的细胞培养瓶是倒置的，第二天翻转培养瓶时才使得组织块浸入培养基里 12 培养到第六天时可见组织块周围有细胞攀爬出来，此后两天便可进行初次传代;三 MSC的原代培养;培养方法;将老鼠引颈处死，放入事先配好的医用酒精内浸泡15分钟后，转移到超净室内。 用大号止血钳夹住鼠尾，用无菌NS.将大鼠身上的酒精冲洗干净后，放入无菌半月盘内，转移至超净台内。剪去鼠尾。 用第一套器械，小心剥离老鼠四肢表皮，露出肌肉层。 用第二套器械，小心剥离老鼠四肢上的肌肉层，露出股骨和胫骨;用第三套器械，小心剥离老鼠的胫骨和股骨 注意：此步骤很关键，在分离四肢股骨、胫骨时要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔 将股骨和胫骨转移到小培养皿内，里面倒入少许NS.，用眼科剪和眼科镊将骨头周围的肌肉组织剥离 将剥离后的股骨和胫骨转移到一新的培养皿内，小心并迅速用大号组织剪剪断骨头两端，暴露骨髓腔。 不建议使用酒精，此步骤以前各步在保证无菌操作情况下可避免染菌; 将剪断的骨髓，用5ml的注射器吸取无血 清培养基反复冲洗骨髓腔。收集骨髓悬液的培养基。 在50ml离心管内加入Ficoll人淋巴细胞分离液，将细胞悬液小心的铺在分离液上层 注意：在操作此步骤时，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上铺细胞时眼睛要与页面平齐 小心封口离心管，离心机内离心，设定为2000r/min, 30分钟 离心后 取出离心管，小心吸取离心管内中间白色云雾层，用无血清培养基混匀后再次离心，设定为1500r/min,10分钟; 将离心后的上清液弃除，用新鲜的全培养 基垂悬细胞，装入细胞培养瓶 15 将细胞培养瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培养 24小时后将细胞瓶内的培养基吸出放入新的培养瓶内，让尚未贴