上5.2多聚酶链式反应扩增DNA.pptVIP

练习 (课堂检测) 1、DNA单链的________末端为3′端, ________末端为5′端,在DNA复制时,引物从模板链的___ 端配对结合.在___________酶的作用下,从引物的____端,使子链向下延伸. 2每次循环可以分为______________________这三个过程,对应温度分别为__________________. 磷酸基团 羟基 羟基 DNA聚合 3/ 变性、复性、延伸 94℃左右、50℃左右 、72 ℃左右 练习 (教材P63) 1、一个DNA片段经过30次循环后能形成________个这样的片段. 2、依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得 DNA=_____________________________ 230 50 x(260nm的读数)x稀释倍数 练习巩固 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘ D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？ 3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作 子链的5′端向 3′端延伸 4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在-20 ℃储存 移液器 返回 离心管 返回 离心机 返回 PCR仪 返回 PCR扩增曲线 引物设计的原则 ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 * * * * * 3/ 5/ G—A C—C 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ G—G 引物Ⅱ 5/ 3/ G—G 引物Ⅱ 5/ 3/ G—G 引物Ⅱ 3/ 5/ 3/ G—A 引物Ⅰ （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA子链。 （二）、PCR的反应过程“三步一循环” 3、每个循环包括：变性 ——复性——延伸 以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率 （二）、PCR的反应过程 1、循环之前的一次预变性 2、PCR 一般要经历三十多次循环 预变性 变性 复性 延伸 （94 ℃,5min） （94 ℃,30s） （1）PCR循环--变性 95℃变性 （1）PCR循环--变性 95℃变性 （1）PCR循环--变性 95℃变性 （2）PCR循环—复性 55℃复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 4、循环特点： ①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中 ③其它子代DNA分子都为双引物分子式 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N ① ② 反应周期 高温变性:90~95 ℃ 低温复性(退火):55~60 ℃ 适温延伸：70~75 ℃ 反应循环数： 扩增倍数： 109以上（ 230 ） 30多次 PCR的基本步骤 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 低温退火 2 高温变性 1 适温延伸 3 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA变性 形成2条单链 DNA单链 与引物复性 子链延