4重组体导入及鉴定.pptVIP

二 、外源DNA导入宿主细胞 融合蛋白表达 非融合蛋白表达 原核细胞表达系统的优缺点： 优点：高密度发酵培养，产量大，成本低 缺点：1）真核蛋白易降解 策略： 利用融合型，分泌型；选用蛋白酶缺陷菌株；在较低的温度下培养细菌等. 2）缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白 质进一步修饰加工，因此很难获得具有活 性的真核蛋白. 策略：选择功能对翻译后加工要求不严格的真核蛋白 原核细胞表达系统 SD MCS 启动子 终止子 Ampr ori 具有表达元件： 强启动子 终止子 SD序列 ORF: ATG, TAA * 作为理想宿主的基本要求 ①能高效吸收外源DNA分子 ②不具有限制修饰系统 ③应为重组缺陷型菌株 ④根据载体类型选择相应宿主 ⑤根据载体标记选择合适宿主 ⑥具有安全性 E.coli表达体系优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达 人类胰岛素基因 生长激素基因 人干扰素基因 大肠杆菌中得到表达 （一）大 肠 杆 菌 常用的宿主细胞 ? 常用的啤酒酵母已被美国确定为安全的生物。 （二）酵 母 ①基因结构相对比较简单，便于基因工程操作； ②培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉； ③外源基因表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。 酵母表达体系优势： ? 表达载体通常是来自动物病毒，如SV40病毒，经人工改造，加增强子、启动子等。 ? 哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。 （三）哺乳类动物细胞 （四）植物细胞 常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统 2.直接分化再生系统 3.原生质体再生系统 4.胚状体再生系统 5.生殖细胞受体系统 抗CMV病毒转基因番茄 外源DNA导入原核细胞 外源DNA导入真核细胞 转化 转染 感染 酵母细胞 哺乳动物细胞 植物细胞 CaCl2 包装 蜗牛酶形成 原生质体 微量注射法 电穿孔法 磷酸钙共沉淀法 原生质体融合法 精子介导法 微量注射法 电穿孔法 农杆菌转化 基因枪法 花粉管法 外源DNA导入原核细胞 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG 介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 基因重组 感染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 1.载体介导转移系统 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 植物转基因常用方法 农杆菌共培养侵染 诱导愈伤组织 分化生芽 生根 叶盘转化法 叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 2.基因枪轰击法 3 花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。 该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 目的克隆的筛选与鉴定 转化后的克隆群体： 1、载体选择标记鉴定 （1）抗生素抗性选择法 （2）插入失活法 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 （3）?-半乳糖苷酶显色反应法 （1）菌落原位杂交 2、目的基因序列鉴定 Southern杂交 纪念发明者—— Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）D