液相色谱分析方法及故障排除.ppt

流动相进口不断有气泡产生 正相色谱中最容易出现的现象 滤杯堵塞 用甲醇或异丙醇超声15min 滤杯中存在少量无法排除的气泡 先将滤杯用甲醇或异丙醇超声清洗后，将滤杯放置于流动相瓶子中，整体超声15min，之后大流量冲洗（purge或prime） 单向阀和流动相入口管接触不紧密 拧紧接头 面板显示压力和平常差异太大 正常压力范围（250 mm×4.6 mm id反相柱，1ml/min流速） 甲醇：7～8MPa 乙腈：3～5MPa 50％甲醇：15～17MPa 面板显示压力和平常差异太大 检查废液流速是否正常 重新调整泵的设置，变成正确流速（con B改成0） 检查管路系统是否漏液 拧紧漏液处的接头 密封圈是否磨损 观察泵头后部下端是否有液体滴出，并且维持一定的速率。带有自清洗的泵，请将自清洗管路拆除观察。如漏液，则必须找管理员同学处理。 泵空载压力过高 在线过滤器堵塞 寻找管理员进行维护 拆开在线过滤装置，用甲醇或异丙醇超声15min，如果还不能降低空载压力，请用硝酸水溶液超声在线过滤。具体浓度请咨询色谱厂家工程师 更换在线过滤器 检测器规律性波动 两种情况 检测器规律性波动 检测池进气泡： 将流动相换成甲醇或乙腈等粘度和表面张力小的物质，大流速（1.5ml/min）冲洗至基线平衡 将柱子和检测器的连接处断开，用注射器向检测池中快速注入甲醇或乙腈，同时在工作站上观察波动是否消失。等检测器上的波动消失后，将检测器的废液出口抬高，其高度必须高于检测器进口的最高点，同时启动泵，至柱后有液体流出，然后迅速将检测器进口和柱子连接，即可排除检测池中的气泡。 检测器噪音信号大 检测池被污染 检查样品池和参比池光值参数，如果样品池参数值低于参比池数值的四倍以上，即说明被污染。 6M硝酸清洗样品池。 清洗时不能连接色谱柱！！！ Time (min.) 检测器显示over 表明检测器的输出信号小于检测器内部设定的下限。 对于Alltech和岛津10A检测器而言，无需理会，对于岛津20A检测器而言，最好用zero按钮将显示over归零。 和数据采集系统相关。 -5000uv 检测 实际情况 硬件系统漏液 岛津色谱面板显示“Leak error” 按面板上“CE”键，消除报警声音 检查组建是否真的漏液，找到漏液原因并作相应处理。处理完毕后用滤纸将漏液传感器擦干。 如果系统没有漏液，说明空气湿度大或者传感器灵敏度设置过高，直接按“CE”消除报警即可继续进行试验 柱压过高 管路堵塞： 分段检查管路：先断开检测器出口管，再断开检测器进口管，再断开色谱柱出口，再断开色谱柱进口，再拧开单向阀上阀和进样阀之间的管路。 卸开哪部分能降低压力至正常水平，即说明所断开的部分堵塞。 软件中的积分问题 出现倒峰－在倒峰处禁止积分 注意：必须选择对检测器 色谱柱的再生 色谱柱污染的现象： 出现侧肩峰，每个峰均如此 色谱柱的再生 反相柱再生 水洗 25～50％异丙醇洗 甲醇洗 二氯甲烷洗 甲醇洗 如果被蛋白质样品污染，用0.05M 硫酸洗。只能是在常规清洗无法奏效的情况下使用。硫酸清洗能降低柱效。 每种溶剂均需要冲洗20倍柱体积。 色谱柱的再生 正相柱再生 正庚烷←→氯仿←→乙酸乙酯←→丙酮←→乙醇 ←→水** 如果是硅胶柱，没有键合氨基或二醇基，则不能用水冲洗，且溶剂必须经过严格脱水。 每种溶剂均需要冲洗20倍柱体积。 谢谢参加 王满意 2007－4－26 HPLC方法建立的步骤 4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件 6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤 5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等 1:了解样品的基本信息 1 分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。 如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。 1:了解样品的基本信息 被分离物质的亲疏水性差异 疏水类基团：苯环、杂环、多环芳烃、烷烃、双键、共轭双键、卤代基团。 亲水类：COOH、OH、NH2、SO3H、CHO、CO、N=NH、SO、SO2、-O-。 疏水性和亲水性是正相色谱和反相色谱分离的基础 经验或者偶极矩做参考 从结构或实验判断出其在溶剂中的溶解度 水溶性或醇溶性用反相，溶于非极性溶剂用反相（没有