进化酶 酶工程与蛋白质工程 教学 讲义.pptVIP

渐增切割法产生杂和酶 Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE 用核酸外切酶III分别消化两个非高度同源的靶基因，控制切割速度不大于10bp/min，每隔很短时间连续取样，迅速终止样品反应，以获得一组一次有几个甚至一个bp缺失的片断，然后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生杂和基因文库，表达该文库，通过酶活测定筛选出理想的重组杂和基因。 不依赖于DNA序列同源性的随机重组文库的构建 同源序列非依赖性蛋白质重组（sequence homology independent protein recombination, SHIPRE） 将2个靶基因串联在同一载体上；PCR将α–硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物中；用核酸外切酶III处理产生不同截短程度的DNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基因长度相似的随机片断，与表达载体连接重组，转化受体细胞，形成表达型杂和蛋白文库。 表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活性的筛选方法，主要依据强发色体底物(颜色变化)、易观察的克隆表现(溶解圈)或荧光产物来筛选突变体。 高通量筛选蛋白质突变体库的方法：如表面展示技术。 2、突变文库的筛选 噬菌体表面展示技术 Phage display techniques