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上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达特征 　　角质形成细胞是鳞状上皮细胞的主要组成成分，具有广泛的生物学特性。常见的鳞状上皮细胞有皮肤和口腔黏膜上皮细胞，当其出现大面积损伤时创口自身不能正常愈合，只能通过组织移植来补偿缺损的组织面。皮肤或口腔黏膜是容易接触一些药物或材料刺激的组织，因此探讨皮肤或口腔黏膜组织对于临床药物和材料的反应是重要的研究课题。 　　体外细胞检测模型一般来自患者的原代培养细胞或来自肿瘤、遗传物质突变的转化细胞系，但原代细胞培养获得的细胞有限，传代后组织特异性也逐渐丧失，且组织来源不同的原代细胞培养所得出的测定数据差异较大，不是毒理学研究的理想细胞； 转化细胞容易获得并易于维持，稳定性高，可重复性好，但其具有肿瘤细胞的特性，例如生长失去控制、接触抑制丧失、细胞外形改变、核型异常等[1],也不是毒理学研究的理想模型，因此，急需建立新的外源性化合物安全性的评价模型。人胚胎干细胞（ hu-man embryonic stem cells,hESCs） 是健康和永生的单一胚胎细胞来源的人类样本，既可真实反映人类生物学特征[2],又可通过单一胚胎细胞无限增殖和定向分化达到样本高度标准化[3],可能成为预测受试物细胞毒性和遗传毒性的体外替代实验模型[4],为体外安全性评价提供了新的希望。将 hESCs 诱导分化为角质形成细胞目前暂无标准化方法，研究发现通过形成拟胚体（ embryonic body,EB） 的方法获得的角质形成细胞增殖能力过低，不利于组织发育[5]; 2008 年，Metallo 等[6]用直接诱导法将 hESCs诱导分化为上皮细胞的前体细胞，并比较了 EB 法和直接诱导法诱导 hESCs 5 周后获得的细胞角蛋白（ cytokeratin,CK） 14 的阳性表达率（ 15% vs. 87%） ,发现直接诱导法具有显著的优势。 　　人永生化口腔上皮细胞系（ human immortalizedoral epithelial cells,HIOECs） 是用人乳头瘤状病毒E6、E7 开放读码框架转染原代培养的正常口腔上皮细胞后建立的[7],HIOECs 具有与口腔黏膜上皮细胞相似的形态和生化特性，所建模型可被用于评价药物在口腔吸收机制的研究[8].人永生化皮肤角质形成细胞 HaCaT 是由成人皮肤转染猴空泡病毒40（ simian virus,SV40） 后发生自分化的未成瘤的永生化皮肤角质形成细胞系[9]. 　　本课题组前期实验亦通过直接诱导法将 hESCs诱导分化为上皮样细胞[10],但尚不清楚所得到的上皮样细胞是否仍保持正常的染色体核型，其进一步分化是趋向于发展为皮肤上皮还是口腔黏膜上皮，以及能否作为将来毒理学的检测模型。本研究对得到的上皮样细胞进行了染色体核型的分析，在基因水平上探讨了由 hESCs 诱导 K-hESCs 过程中多能性标志物及上皮相关标志物的表达变化； 并以人原代牙龈上皮细胞 （ human gingival epithelial cells,HGECs） 、HIOECs 和 HaCaT 作为对照细胞，通过实时定量荧光 PCR 方法检测了其诱导末期人胚胎干细胞源角质形成细胞（ keratinocyte derived from hu-man embryonic stem cells,K-hESCs） 与对照细胞上皮相关标志物基因表达的差异性； 在蛋白水平上，通过免疫组织化学方法探讨了多种上皮细胞相关标志物在 K-hESCs 和对照细胞中的表达差异。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　研究所用明胶、Matrigel 购自美国 BD 公司，胚胎干细胞完全培养基（ mTeSR1） 购自美国 Stem Cell公司，中性蛋白酶购自德国 Roche 公司，CK、波形蛋白（ vimentin,VIM） 抗体购自美国 Santa Cruz 公司，细胞培养瓶及培养皿购自美国 Corning 公司，通用型二步法检测试剂盒购自美国 GBI 公司，TritonX-100 购自美国 Amresco 公司，Gimsa 染液购自北京Solarbio 公司； 其他研究所用材料全部购自美国Invitrogen 公司。 　　1. 2 细胞培养 　　1. 2. 1 hESCs 的培养 人胚胎干细胞系 H9 （ H9-hESCs） 由新加坡国立大学提供，将其培养于 Matri-gel 上，培养液为胚胎干细胞完全培养基，每天换液，细胞接近汇合时用 1 g/L 的中性蛋白酶，37 消化5 min,机械刮除，800 r / min 离心 5 min,1 6 传代。 　　1. 2. 2 HGECs 的原代培养 选择拟行阻生牙拔除术、无口腔黏膜疾病且冠周龈组织无炎症表现的患者，术前征得患者同意，术中收集拔除牙齿上