第十五章--酵母基因工程.pptx

第15章酵母基因工程o 酵母基因工程的发展o 酵母表达系统o 酿酒基因工程的应用15.1 酵母基因工程的发展o 酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核微生物， 种类繁多，至少包括80个属，600多种，10 000 多菌株。o 酵母菌有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达 调控机制，它既能通过有丝分裂进行无性繁 殖，也可通过减数分裂实现有性繁殖。1 15.1.1 酵母基因工程的优点① 是真核生物，大多具有较高的安全性；② 繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工 程产品成本的潜力；③ 将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真 核生物中复杂的转译后修饰能力相结合，能方 便地用于外源基因的操作；④ 采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而 且可诱导调控；⑤ 提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物与 天然蛋白一样或类似；⑥ 酵母菌可将表达的外源蛋白与末端前导肽融合，指 导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白 进行糖基化修饰；⑦ 不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯；⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使用中引起 免疫反应的问题；⑨ 酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序， 它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对 表达产物的加工修饰及分泌能力；⑩ 酵母可进行蛋白的N-乙酰化、C-甲基化，对定向到 膜的胞内表达蛋白具有重要作用。215.1.2 发展现状o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。 1．酿酒酵母自身的改造⑴ 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母，水解多糖⑵ 将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母,水解 麦汁中蛋白⑶ 将β-葡聚糖酶基因导入酵母， 水解β-葡聚 糖⑷ 将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒 酵母体内表达，促进SO2产生⑸ 将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵 母32．酵母表达异源蛋白⑴ 表达水平o 酵母的高效表达:通过开发高效的启动子提高 和控制外源基因的转录水平；提高表达载体在 细胞中的稳定性；通过多次同源重组以及介导 的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝 数。⑵ 表达质量o 提高酵母的遗传稳定性。o 根据表达蛋白的不同，选用不同的酵母宿主。15.1.3 发展趋势1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向3．利用酵母基因工程筛选更多的新药4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注415.2 酵母表达系统15.2.1 酵母表达载体典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列（2）载体的复制形式① 附加型载体o 在酵母宿主中的拷贝数量大，但在传代过程中 易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。o 两类： （1）利用酿酒酵母2μm质粒的DNA复制有关的 元件所构建，这类载体转化效率很高，每 μgDNA可得103-104个转化子； （2）利用酵母基因组DNA的自主复制序列，能 在酵母染色体外自主复制。5 ② 整合型载体o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。6NTS1 RFBNTS2 ARS5S35S18S5.8