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紫外分光光度法 紫外—可见分光光度法基本原理 紫外-可见分光光度法是各种光谱的基础，是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析测定的一种仪器分析方法，它是测定物质对紫外区、可见区波长的选择性吸收而产生的吸收光谱，并借助吸收光谱对被测物质进行定性分析和定量分析。 吸收光谱的产生 紫外—可见吸收光谱属分子吸收光谱，是由分子的外层价电子跃迁产生的，也称电子光谱。它与原子光谱的窄吸收带不同。每种电子能级的跃迁会伴随若干振动和转动能级的跃迁，使分子光谱呈现比原子光谱复杂得多的宽带吸收。当分子吸收紫外—可见区的辐射后，产生价电子跃迁。 紫外吸收光谱与分子结构的关系 有机化合物的紫外吸收光谱常被用作结构分析的依据，因为有机化合物的紫外吸收光谱的产生与它的结构是密切相关的。 紫外/可见分光光度计的分类及特点 1、单光束分光光度计 一束经过单色器的光，轮流通过参比溶液和样品溶液，进行光强度的测定。噪音小，信噪比高。 2、双光束分光光度计 经单色器的光一分为二，一束通过参比池，另一束通过样品池，一次测量可得到样品溶液的吸光度。可消除光源强度变化引起的误差。 3、双波长分光光度计 同一光源发出的光被分为两束，分别经过两个单色器，交替照在同一溶液里，测到两波长吸光度之差。可测定浑浊样品。 应用领域 1、在医药、化工、冶金、环保、地质等 领域。 2、细菌、酵母培养物的浓度的测定。 3、蛋白质、核酸、多肽等物质的测定分 析。 4、酶催化反应中产物的产生和底物的消 失的追踪。 仪器 1、 DU640紫外分光光度计 产地：美国 2、U-2810紫外可见分光光度计 产地：日本 DU640仪器结构与原理 DU640紫外分光光度计系统是内含微机控制的单光束紫外/可见分光光度计，波长范围190~1100nm，其组成有：光源、单色器、样品池、温控 器、检测器、显示系统、打印系统组成。 光源 由钨灯和氘灯组成，分别用于可见光区和紫外光区的光源。其基本要求是：能够发射足够强度的连续光谱，稳定性好，辐射能量随波长无明显变化。 单色器 单色器的作用是从连续光谱中分离出所需要的足够窄波段的光束，它是分光光度计的核心部件，其性能影响到测定的灵敏度、选择性和工作曲线的线性范围。 吸收池 吸收池根据材料有玻璃吸收池和石英吸收池，前者用于可见区，后者用于紫外和可见区。 检测器 检测器使用的是光电倍增管，其特点是响应速度快，灵敏度高。 温控器 半导体控温系统，可在10—90℃范围内快速调节，为需要温度的此类反应如酶动力学研究提供了非常便利的条件。 功能 可提供三种标准的常规的测量方式，即固定波长 分析、全波长扫描和时间动力学测定。除此之外 还有一个非常明显的优势是可以选配在生化和分 子生物学方面常用的一些测试软件及相应的配 件，很容易扩充仪器的测试功能，因而被誉为生 化型紫外分光光度计。 所配置应用软件： ⑴ 蛋白质测定软件：有双缩脲法、UV法等8种方法。 ⑵ 核酸测定软件：有4种指定的参数法和一组通用法。 ⑶ DNA/Oligo Quant Analtsis：有9种针对DNA和RNA的方法。 ⑷ 酶机理研究软件。 紫外一可见光分光光度计的发展趋势 分光光度计的发展趋势可以从下列两个方面来看：(1）分光光度计的组件(如单色器、检测器、显示或记录系统、光源等)的改善与发展 (2)分光光度计的结构(如单波长，双波长快速扫描、微处理机控制等)的发展。 下一章： 荧光分析法 * * 当光进入一种物质后，如果能量被全部或部分吸收，则在吸收光的过程中，光能被转移给分子，但吸收是高度专一的，即一定结构的分子只吸收一定能量的辐射。处于基态的分子受到光能激发时，它可以吸收特征波长的能量，跃迁到较高的能级（激发态），产生吸收光谱。吸收的能量越多，跃迁的能级越高，波长越短。据此就可以根据吸收光谱的形状，特别是吸收峰的波长位置对物质进行定性分析。 BECKMAN-DU 640紫外分光光度计