第四章 DNA重组和基因转移教程文件.ppt

第四章 DNA重组和基因转移 第一节 目的基因与载体的连接 一 粘末端DNA片段的连接 （一）具有相同粘末端的DNA分子 之间的连接 使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 （二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。 HindIII EcoRI HindIII EcoRI 对载体酶切 HindIII EcoRI 对基因酶切 质粒载体的定向重组 二 平末端DNA片段的连接 1 直接用T4连接酶连接 2 同聚物加尾法 3 衔接物连接法 衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。 所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。 1 按照平末端连接方法加上接头 2 将凹端变为平端 （1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平。 （2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子 三 载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接 四 cDNA与载体的连接 通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆 第二节 重组DNA分子的筛选与鉴定 外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况： （2） （3） （1） 转化 E.coli 一 遗传检测法 （一）根据载体表型特征选择重组体分子 1 抗药性标记插入失活筛选法 例：pBR322 如果外源基因插入到tetr基因内部，tetr抗性消失，表型为不抗四环素（tets）、而仍抗氨苄青霉素（ampr），这样的转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有tet的培养基平板上生长，在含有 amp的培养基不能生长。 例: pUC质粒 在LacZ—的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α—互补，菌落呈蓝色。 如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体 进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达，产生出有功能活性的基因产物，那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。 2 α—互补 二 物理检测法 凝胶电泳检测法 三 核酸杂交检测法 例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑) 四 免疫化学检测法 免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。 标记抗体测定法的步骤： 转化菌落 影印平板 置于含氯仿饱合气体的容器 细菌裂解，抗原释放 覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜 形成抗原抗体复合物 将NC膜与I125标记的抗体温育 放射自显影 与母板对照，挑取所需的重组克隆 用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因 第三节 基因转移方法 一 重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化 将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。 为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。 对于大肠杆菌细胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液来制备感受态细胞。 （1）吸附阶段：完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面 （2）转入阶段：双链DNA分子解链，以单链形式进入细胞， 而另一链则被降解 （3）自身稳定阶段：外源质粒在细胞内又复制成双链环型 DNA （4）表达阶段：即目的基因随质粒的复制子一起复制，并被 转录、转译 DNA分子转化的过程： 质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响： （1）大小 ＞ 10Kb，转化效率很低 （2）构型 超螺旋＞环形＞线状