DNA电镜技术及其应用.pdfVIP

医学生 DNA电镜技术及其应用 文字表述：关键词： DNA电镜技术 应用 　　电子显微镜作为一种研究工具在核酸研究中已发挥很大作用并日益受到重视。1859年人们首先发 现核酸为活体组织细胞核的主要组成成分，90年后又在电镜下观察到单个核酸分子，而Avery等 新时代［1］。以后经过方法学上的不断改进，又发展了许多新的技术，广泛应用于DNA结构与功能以 及蛋白质-DNA相互作用的研究。我们参阅了近三十多年的有关文献并结合本实验室从事核酸电镜技术 研究的体会，就DNA电镜的常用技术及其基本应用加以介绍。 　　1　DNA电镜样品制备方法 态，电镜观察前必须将DNA分子变为二维伸展状态非聚集分子。细胞色素C展层技术的原理就是将DNA 溶液与碱性蛋白(细胞色素C)混合，带负电的DNA分子非特异性吸附大量细胞色素C，而后者具有在水 或低盐溶液表面变性形成单层膜的特性，这时缠绕其中的DNA分子也随之展开呈二维伸展状态。将变 性剂(如甲酰胺等)加入展开液中，可以防止单链DNA分子内碱基非随机配对。细胞色素C展层技术不仅 细，形态较为曲折。下相液中甲酰胺浓度比上相液中低30%，缓冲液离子浓度为上相液中的10%。 　　1.2　扩散方法［4］　扩散方法是碱性蛋白膜技术的一种变化形式，其原理是碱性蛋白在含DNA 的下相液表面形成单层蛋白膜，DNA分子通过扩散运动与蛋白膜接触并吸附其上。该方法可以大大减 所用DNA量较少，另外在展开单链DNA时可加入50%甲酰胺。 馏水上展开。上述方法对技术条件变化敏感，下相液所用水必须为新蒸馏水或超纯水并经快速预冷。 取样时最好用处理过的碳膜。处理方法有辉光放电［6］、溴化乙锭(EB)［7］、多聚赖氨酸(Mr2 000)及Alcian blue等。 用于无蛋白制样技术。Griffiths对蛋白质-DNA复合体的电镜研究亦有详细描述［9］。 微术中最有希望获得生物标本自然结构的手段。其理论基础是基于防止纯水或溶液经快速冷冻后冰晶 形冰晶，而-160℃以下形成无定形冰，即玻璃态冰。快速冷冻后DNA样品中的水直接变为玻璃态冰， 可以避免因形成冰晶造成结构损伤。在微筛支持膜上制备玻璃态含水的DNA样品，加一套减少电子辐 射损伤的电镜技术和相衬成相方法，可以获得高分辨率的近于自然状态的DNA结构图像。该方法也避 免了传统电镜制样时脱水、固定、吸附、染色、喷镀等处理对样品结构的破坏。其制样方法为：将3 的液体乙烷中，经低温传输装置转移到冷冻样品台或储存于液氮中。为获得DNA样品的高质量图像， 要选择合适的微筛孔径及样品厚度，微筛的制备可用Murray建立的方法。 不同，有必要对不同的产品进行预试验，以选择最好的产品。为使DNA电镜图象背景平滑、均匀，可 很大，应经纯化［11］或去离子处理［12］。 　　1.6　支持膜［13］　细胞色素C展层技术中常用火棉胶膜，新制备的膜吸附性能及反差效果最好 。无蛋白展层技术使用碳膜最好，碳膜较稳定，污染小，但制备较火棉胶膜困难。低温电镜则需特殊 的微筛支持膜。 进行旋转喷镀，可使DNA分子获得足够反差。 　　2　长度测量 计算其相对分子质量大小。样品在展开过程中展开力对DNA的作用及测量误差会对测量结果产生影响 。为排除这些因素的影响，制样时应加入已知相对分子质量的DNA分子作为标准，根据长度比值，也 测定仅需5 μg DNA。 　　3　DNA∶DNA异源双链绘图 　　异源双链方法可以检测不同类型DNA分子间的同源序列。将两种DNA分子进行碱变性或热变性后退 火，同源序列部分杂交呈双链结构，非同源部分不能配对，在甲酰胺存在情况下维持双链状态，电镜 下可显示三种结构特征：(1)除插入或缺失外，在两种DNA分子均相同时，插入或缺失部分在双股异源 双链分子中呈单链插入/缺失环；(2)两种相同的DNA分子某一区域为其他序列取代，替代区域形成两 股不能配对的单链(即替代环)；只有小段DNA相同时，则形成一短的双股区，两侧为不能配对的单链 ；(3)许多单个碱基不同的两种DNA分子形成间隔异源双链含一系列单链及双链区，电镜下可以确定其 ［17］，发现了侧枝移动现象［18］，确定了Ig可变区的编码区域［19］。 　　4　标记方法 上再用传统方法制样即可解决此问题。 。由于铁蛋白分子较大，会损害探针的生物特异性及结合活性，因此利用生物素-(链霉)亲和素的高 可以掺入核酸分子内［22］或加到RNA的3′末端。生物素化分子与偶联铁蛋白的亲和素或链霉亲和素 白的氨基基团，再与抗DNP抗体反应，尔后结合铁蛋白或胶体金标记的抗IgG；也可结合生物素化 可达7