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Gene32蛋白对PCR产量的影响 临床检验杂志 1999年第3期第0卷 临床化学 作者：李经忠　孟红　郭进林 单位：山东省医学科学院基础医学研究所，250062 关键词：Gene32蛋白；PCR 　　在临床检测和科研中，有时因引物对原因，PCR产量低，不利于结果观察。在PCR检测血清HBV基因的同时，加入Gene32蛋白，提高了PCR产量和灵敏度。 　　1　材料与方法 　　1.1　基因32蛋白(Gene32 protein)(Pharmacia)，2.5 mg/ml。 　　1.2　Taq DNA聚合酶(华美公司)。 　　1.3　dNTPs(华美公司)：dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L。 　　1.4　提取的乙肝血清核酸(应用白蛋酶K/酚/氯仿法)。 　　1.5　10×Taq聚合酶缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，0.01 g/dl gelatin)。 　　1.6　乙肝基因引物　上游引物：H1，5′-CCATACTGCGGAACTCCT-3′，起始于HBV基因组的聚合酶基因的1267位点［1］，下游引物H2，5′-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3′，起始于HBV基因组X基因的1546位点。此引物对扩增的特异产物大小为279 bp，对四种血清型的HBV均适用。引物由上海生工生物技术公司合成。 　　1.7　方法　5 μl 10×Taq聚合酶缓冲液，4 μl dNTP，5μl 10 μmol/L H1引物，5 μl 10 μmol/L H2引物，5 μl血清HBV核酸，26μl双蒸水，2 U Taq DNA聚合酶混合在一起，共制备4管反应液。第一管加入0.5μl Gene32蛋白，第二管加入0.25 μl Gene32蛋白，第三管加入0.125μl Gene32蛋白，第四管未加。每管加入25 μl液体石蜡，离心后加在PCR热循环仪上。程序如下：94℃，变性5 min；30个循环：每个循环包括94℃变性1 min，54℃复性50秒，72℃延伸1 min；末梢延伸72℃ 5 min。反应产物在2 g/dl琼脂糖(含0.5 mg/L溴化乙锭)，1×TAE电泳缓冲液中电泳，每份取10μl反应产物加2 μl 6×上样缓冲液(30%甘油＋0.25 g/dl溴酚蓝)，5 v/cm，电泳30 min，观察结果。 　　上述4管PCR反应产物各取40 μl用PCR产物纯化试剂盒(上海华顺公司)纯化，去除多余引物、酶、无机盐、矿物油、dNTP等，后经7530-G uV-VIS光谱仪分析结果。 　　2　结果 　　4管产物的电泳结果见附图,可见在50 μl的反应体系中,加入1.25μg和Gene32蛋白可大大提高PCR产量,有利于HBV基因的检出。 　　4管产物的纯化产物,经光谱仪分析各为11 μg/40 μl、4.1 μg/40μl、2.1 μg/40 μl、1.2 μg/40 μl。在50 μl反应体系中,加入1.25 μg的Gene32蛋白，与不加者相比，产量可提高近10倍。 　　第1道，pBR322/Msp I ladder。第2道，为加入0.5μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的PCR反应产物。第3道，加入0.25 μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的反应产物。第4道，加入0.125 μl(2.5 mg/ml)的Gene32蛋白的反应产物。第5道未加Gene32蛋白。 附图　Gene32蛋白对PCR产量的影响 　　3　讨论 　　Gene32蛋白是一个单链核酸结合蛋白,由T4噬菌体基因32(Phage t4 gene32)编码。它对T4噬菌体DNA的复制是必需的,通过结合在单链区起协同作用,对双链的螺旋结构有去稳定性的作用[2]。 　　克隆的基因32蛋白可提高T4DNA聚合酶活性[3,4],改善限制性酶的酶切作用[4]。Gene32蛋白在电子显微镜下,可区分单链和双链核酸[6]。基因32蛋白尚可用于识别受损的DNA[7]。Schwarz等报道,应用基因32蛋白可使长链PCR产物的产量至少提高10倍[8]。 　　参考文献 　　[1]Ono Y,Onda H.Sasoda R,emet al/em.Nucleic Acids Res，1983，11：1747～1757 　　[2]Williams K R.emet al/em.J Biol Chem，1981，256：1754 　　[3]Huberman J A，Kornberg A. J Mol Biol，1971，63：39 　　[4]Topal M D，Sinha N K.J Biol Chem，1983，258：12274～12279 　　[5]Dom