N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯柱前衍生HPLC分离荧光检测肽及其水解产物.docVIP

N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯柱前衍生HPLC分离荧光检测肽及其水解产物 【关键词】 高效液相色谱法 摘 要 探索了N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯（SIFA）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）、三甘肽（Gly-Gly-Gly）、二甘肽（Gly-Gly）和组成它们的氨基酸-谷氨酸（Glu）、胱氨酸（Cys2）、甘氨酸（Gly）反应的衍生条件以及其衍生物的色谱分离条件。于含pH8.5的0.2 mmol/L H3BO3-Na2B4O7缓冲溶液中衍生25 min，衍生反应液直接进样，采用C18柱，以含42%甲醇的pH5.0 10 mmol/L H3cit-Na2HPO4缓冲溶液为流动相，在λex/λem＝492/513 nm处荧光检测，分离测定了六种肽及其组成氨基酸的衍生物，检出限为0.64～12 fmol。该方法具有流动相体系简单、灵敏度更高等优点。 关键词 高效液相色谱法；N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素-O-乙酸酯；荧光衍生试剂；肽 N-hydroxysuccinimidyl fluorescein-O-acetate as a fluorescent derivatizing reagent for oligopeptides and their hydrolysates Abstract Some oligopeptides and their hydrolysates such as GSSG, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Glu and (Cys)2 were separated and determined by HPLC-fluorescent using SIFA as precolumn derivatizing reagent. The fluorescent properties of SIFA and its derivatives were examined, and the effects of the pH value and CH3OH concentration were studies. In the CH3OH-H2O（7:3,V/V）solution containing pH8.5 H3BO3-Na2B4O7 buffer, SIFA was derivatized at 30 ℃ for 25 min. The resulting fluorescent derivatives were separated on a C18 column using φ(CH3OH)=42% solution containing 10 mmol/L H3cit-Na2HPO4 （pH5.0） as the mobile phase and detected spectrofluorimetrically at 513 nm with excitation at 492 nm. The detection limits was 0.64～12 fmol（S/N=3）. Key words HPLC；N-hydroxysuccinimidyl fluorescein-O-acetate（SIFA）；fluorescence detection; peptide 近10年来，与生命科学有关的生物活性肽的研究日益受到人们的重视。高效液相色谱―荧光检测由于具有较高的灵敏度和选择性，成为目前分离和检测肽的一种十分有效的技术，并在肽分析中得到广泛的应用［1］。由于除含苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的极少数肽具有微弱的荧光以外，绝大部分肽本身都没有荧光，因此必须进行衍生才能使肽成为荧光检测的化合物。目前常用的荧光衍生试剂有荧光胺、邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNS-C1）、荧光素异硫氰酸酯等。OPA和荧光胺虽然灵敏度较高，但是它们的衍生物稳定性较差，且只能与一级氨基化合物反应。DNS-Cl与荧光素异硫氰酸酯虽然都具有能跟一、二级氨基化合物衍生且衍生产物稳定等优点，但DNS-Cl能与醇酚的羟基、巯基以及部分氨基化合物中的咪唑基反应而选择性较差。使用荧光素异硫氰酸酯衍生时需要真空干燥以除去过量试剂，对固定相损害较大而缩短了柱子寿命且操作繁琐。 N-羟基琥珀酰亚胺活性酯是一类较新的胺基化合物的衍生试剂。目前报道的主要有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯（AQC）［2］、N-羟基琥珀酰亚胺-α-(9-菲)-乙酸酯［3］、N-羟基琥珀酰亚胺-α-萘乙酸酯［4］、N-羟基琥珀酰亚胺-3-吲哚乙酸酯［5，6］和N-羟基琥珀酰亚胺-9-芴甲基碳酸酯［7］等。这些试剂与氨基具有较强的选择性反应能力，不与羟基、巯基等反应，过量试剂迅速水解，干扰较少等优点。 我们首次合成的新荧光衍生试剂N-羟基琥珀酰亚胺