传统生化制药存在的问题培训资料.ppt

发酵液 细胞分离 细胞破碎 固液分离 细胞碎片分离 包含体 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 胞外产物 发酵液的预处理：发酵结束，对发酵液进行适当加热、调整pH、加入絮凝剂等预处理，以改变发酵液的性质，便于以后的提取。 初级分离阶段：在细胞培养结束之后，其任务是分离培养液、破碎细胞释放产物（如果产物在胞内）、溶解包涵体、复原蛋白质、浓缩产物和去除大部分杂质等。 纯化精制阶段：在初级分离的基础上，用各种高选择的手段和方法，将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求。 四、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 （1）细胞分离： 细胞分离常用的是离心分离的方法 膜过滤法液逐步得到应用（微滤） （2）细胞破碎技术 工程菌高效表达的产物大部分在胞浆内； 细胞壁以肽聚糖为骨架，由乙酰葡萄胺和乙酰胞壁酸交替排列，形成有一定韧性的网状结构。 机械破碎方法 超声波法 在15—25千赫(kHz)的频率下操作； 操作时易引起温度上升，需要对细胞悬液做冷却处理； 大规模操作，因需要输入很高能量，提供必要的冷却而难于实用； 适用于破碎少量细胞，尤其是破碎包涵体表达的细胞。 高压匀浆法： 细胞悬液在高压匀浆器中受瞬间失压和高速流动形成的剪切、碰撞的作用，使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 高速珠磨法： 细胞悬液和助磨剂在高速珠磨机中被快速搅拌研磨，经剪切、碰撞，促使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 非机械破碎方法 酶解法：常用溶菌酶等破坏细胞壁 酶价格昂贵 、纯化过程中需除尽； 不适于大规模生产。 渗透压冲击法 适于细胞壁较脆弱或用酶预处理的菌体； 适用于分离周质空间分泌表达的基因工程产物。 反复冻融法 破碎率低； 引起对冻融敏感的蛋白质变性。 化学裂解法 用有机溶剂（苯、甲苯）和表面活性剂(SDS等)、抗生素、变性剂等改变细胞壁或细胞膜的通透性； 应防止目的产物变性。 人胰岛素原表达法 生产技术的评价 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 3. 分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体形式存在于胞质中。 将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-内酰胺酶基因拼接，β-内酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效、可分泌型融合蛋白表达的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。 传统方法治疗癌症：痛苦，副作用较大，易复发和转移；20世纪70年代，哈佛大学医学院Judah Folkman教授发现“人体大部分肿瘤的生长和转移都依赖于病理条件下的血管形成”，并提出了著名的“饿死肿瘤疗法”，即通过阻断肿瘤新生血管生成，切断肿瘤营养供给，从而达到抑制和治疗癌症的目的，为癌症治疗指出了一条新的途径——饿死肿瘤疗法。 例：基于饿死肿瘤疗法 的生物药物的研究开发 血管生成是受很多正性因子（生长因子）和负性因子（抑制因子）等调节的复杂的生理过程。 1.单克隆抗体Avastin的研究开发 VEGF是能够刺激血管形成的最重要的生长因子，它由肿瘤细胞表达，可直接作用于血管内皮细胞，刺激其有丝分裂的发生，从而促进新生血管的生长，是最重要的血管形成因子之一。2004年FDA批准上市的Avastin就是针对VEGF的单克隆抗体，可以封闭VEGF，使VEGF不能与其受体相结合，同时可以针对肿瘤细胞起作用。 2.特异性酪氨酸激酶抑制剂的研究开发 大量的研究发现，肿瘤区域新生血管高表达VEGF的受体（VEGFR），是肿瘤部位所特有的，因而可以作为血管靶向治疗的理想靶点。VEGFR的特点是催化域内有酪氨酸激酶插入区，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，在细胞的生长和分化中起重要作用。在VEGFR系统中，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂能抑制血管内皮细胞的再生（即抗血管再生），因此通过应用特异性酪氨酸激酶抑制剂可以达到血管靶向治疗的目的。 抗癌新药埃克替尼 盐酸埃克替尼（Comana，克美纳）是以表皮生长因子受体（EGFR）激酶为靶标的新一代靶向抗癌药，是我国科研工作者和肿瘤临床专家自主创新的第一个小分子靶向抗癌药，其第一个适应证是晚期非小细胞肺癌。 克美纳由