発光量子収率-秋山研究室.PPT

発光色決定の諸説 モノアニオン?ジアニオン説 発光生成物オキシルシフェリンの励起一重項状態 モノアニオン →　赤色発光　　 　 ↑↓±H+ 　 ジアニオン → 　黄緑色発光 　　 回転角説 C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる MaCapra, F., Gilfoyle, D. J., Young, D. M., Church, N. J., Spencer, P., Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley Sons, p387 (1994). オキシルシフェリンのpolarization説 Luciferaseに取り込まれているオキシルシフェリンの電子状態によって決まる Ugarova, N. N., Brovko, L. Y., Luminescence, 17, 321 (2002). * 発光量絶対値測定　　　　－ ホタル－　ルミノールの発表は無し … 2006.6.29 秋山研 PD　安東 頼子 　　　　　　　　　 　　●研究の背景と目的 　　　　　　　　　　　 　　　　●発光量絶対値測定　ー ホタル ー 　　　　　　　　　　　　　 　　　　●今後の展開 研究の背景と目的 発光量子収率 vs pH 　　 (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) 1959年 発光量子収率 88% 1961年　ルシフェリンの構造決定と合成 　　 　光学異性体のD体のみが発光に寄与 年 旋光度 合成 D-ルシフェリン： -36.0° 精製 ルシフェリン： -0.6° 精製ルシフェリンはラセミ化が進み D体とL体が約50%ずつになっている 88±25% (pH 7.6, Photinus pyralis) Seliger McElroy (1959) ① 発光量子収率 発光量子収率???1個の基質分子が 　　　　　　　　　　　 1フォトンを放出する確率 発光スペクトル(北米産ホタル) vs pH 　　　 　 　　 　 Yellow-green emission Red emission 中性付近：560nmピークの非対称形状を持つ黄緑色発光 酸性側 ：616nmピークの非対称形状を持つ赤色発光 ② 発光色変化 その1 (H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1959)) pH7.1 pH5.4 pH6.3 発光スペクトルがpHによって変化する Seliger McElroy (1959) (近江谷克裕 (2004) 生化学, 第76巻, 第1号, p.5-15) pH感受型：ミヤコマドボタル、北米産ホタル 　　　　　　　　　ゲンジボタル、ヘイケボタルなど pH非感受型：イリオモテボタル、ヒカリコメツキ 　　　　　　　　　　　など 酵素の種類によって発光スペクトルのpH依存性が異なる ② 発光色変化　その２ 　 酵素の種類によっても異なる !? 　 ① 発光量子収率 　　高効率の発光反応機構の解明 　　ex) CIEEL機構 etc… ②　発光色変化 ルシフェリンやその誘導体を用いた生物?化学発光、吸収?蛍光測定 色々な種類の酵素やその遺伝子組換え体を用いた生物発光測定 酵素やその生成物との複合体のX線構造解析 ex) モノアニオン?ジアニオン説、 結合回転説、 ケトン共鳴状態説、 　　　　　 オキシルシフェリン 電荷偏り説、 酵素の構造差異説 考え方の基本は、2つの発光成分の平衡状態によって 発光スペクトルが変化するというもの → 未だに決着していない．．． 絶対値発光計測は不可欠 ! 研究の現状 発光量絶対値測定　ー ホタル ー ホタルの絶対値発光スペクトルと発光量子収率 - 絶対値発光スペクトル - - 発光量子収率 - Firefly luciferase : Natural “Photinus pyralis” 　　　　　　　　　　　　 （ＳＩＧＭＡ） Quantum yield : 41.0 ± 7.4 % (pH 8.5)　 Luminescence yield