应用微生物学实验一 微生物菌种的分离纯化教学教案.ppt

应用微生物学实验;实验室安全;实验准备;实验过程;实验报告;课程内容（二）;实验一 微生物菌种的分离纯化 ;二、实验原理 工业微生物菌种最初都来自于自然界，土壤是微生物生长的大本营。但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。;在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的稀释，按微生物生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种。由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。 分离微生物菌株最基本的方法是稀释法。将样品放在无菌水中，通过振荡，使微生物悬浮于液体中，然后静置一段时间，由于样品沉降较快，而微生物细胞体积小沉降慢，会较长时间悬浮于液体中。通过对微生物悬浮液的进一步稀释和选择性培养，就可以分离出我们需要的目的菌株。 ;作为工业发酵菌株必须具备的基本特征： 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易控制； 抗杂菌的抗噬菌体能力强； 遗传稳定性高，不易退化； 不产生有毒有害的生理活性物质或毒素（食品和医药微生物）;三、实验器材与试剂 1. 器材 高压灭菌器，恒温干热干燥箱，超净工作台，天平，磁力搅拌器，电磁炉，移液器，混匀器 1 mol/L HCl，1 mol/L NaOH，无菌水（50mL 5个）、 100mg/L制霉菌素、100mg/L硫酸链霉素、100mg/L氨苄青霉素 量筒、玻棒、三角瓶、15mL具塞试管、无菌培养皿、2mL冻存管、冻存管架、tips、牛皮纸等 样品 植物根围土壤样品；植株;培养基 营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 10g，琼脂 20g，加水至1000mL，pH 7.2-7.4 高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5 g, MgSO4? 7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 ? 7H2O 0.01g，琼脂20g，加水至1000mL，pH 7.2-7.4 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200g，煮沸30min后过滤，滤液中加葡萄糖20g、琼脂20g，补水至1000mL，pH自然 ;四、实验步骤 培养基制备：配制上述三种培养基各1500mL，分装在500mL三角瓶（每瓶250mL，6瓶）中，121℃灭菌20min ； 用移液器取9mL蒸馏水置于15mL具塞试管中（5个）；另准备1mL离心管、tips等，121℃灭菌30min。 1mL离心管、tips烘干备用。;稀释分离法分离微生物 取1mL离心管4个，用记号笔标上10-2、10-3、10-4、10-5，用移液器吸取0.9mL无菌水，加至每个离心管中； 称取样品1g，放入装有9mL无菌水的具塞试管中，振荡10min，即为10-1的土壤稀释液； 10-1土壤稀释液振荡后静止2min，用移液器吸取0.1mL悬液加至装有0.9mL无菌水的离心管中，制成10-2稀释液……依次稀释至10-3、10-4、10-5稀释液。 用移液器分别吸取10-5、10-4、10-3 、10-2稀释液0.1mL悬液，加至无菌的培养皿中，每浓度重复3皿；将灭菌后冷却至50-60℃的培养基（在细菌和放线菌培养基中加入制霉菌素使之达到100mg/L，以抑制真菌生长；在真菌培养基中加入链霉素、氨苄青霉素使之达到30mg/L，以抑制细菌生长）倒至加有土壤稀释液的培养皿中，每皿15-20mL； 将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，细菌37℃培养1-2d，放线菌30℃培养5-7d，真菌25℃培养3-5d。 计数每个培养皿上生长的菌落数，并挑取有代表性的单菌落，在相应培养基平板上划线，直至得到纯培养；纯化后的菌株转接到斜面培养基上保存。;准备下次实验课的培养基与试剂;马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200g，切小块，煮沸30min后过滤，滤液中加葡萄糖20g，琼脂20g，补水至1000mL，pH自然 淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂 20g，加水至1000mL，pH 7.2-7.4 蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖0.5g，NaCl 5g，K2HPO4 0.5g， KH2PO4 0.5g，酪蛋白10g，琼脂 20g，加水至1000mL，pH 7.5 （注意：琼脂粉，按照每个三角瓶中培养基的体积，分装到三角瓶中）