微生物遗传育种第三章 节 突变的应用.ppt

注： 如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物 抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高 抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等共同使用，提高产量的效果会更好。 结构类似物和代谢终产物 终产物 结构类似物 过量积累产物 精氨酸 D-精氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 AEC 赖氨酸 酪氨酸 对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸 酪氨酸 色氨酸 5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸 色氨酸 脯氨酸 3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍 脯氨酸 腺苷酸 2-氟腺嘌呤 腺苷酸 葡萄糖 2-脱氧葡萄糖 b-葡萄糖苷酶 蔗糖,麦芽糖 2-脱氧棉子糖 蔗糖酶 纤维二糖,葡萄糖 甘油 纤维素酶 第四节 其它类型突变型的筛选及应用 一、组成型突变株的筛选 组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。 筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。 筛选方法： 创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势； 选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落，从而把组成型突变株选择出来。 限量诱导物恒化培养法 控制低于诱导浓度的诱导物作碳源进行恒化连续培养。诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长。通过连续不断加入新鲜基质，野生型就会被“洗出”，组成型突变株就被不断“浓缩” ，最后达到能分离的浓度。 （二）营养缺陷型突变株的应用 科研上： 研究代谢途径； 基因重组的遗传标记菌种； AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 生产上： 氨基酸，核苷酸等发酵产品生产菌种的代谢调控育种； 生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记 营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用 阻断代谢途径，积累中间代谢产物 例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟氨酸 谷氨酸 N-乙酰 谷氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酰 琥珀酸 精氨酸 营养缺陷 反馈抑制 (1) (2) SAMP AMP XMP IMP GMP R-5-P AMP脱氨酶 (3) GMP还原酶 阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物 例：利用XMP- 生产 AMP B.subtilis C. glutamicum 高丝氨酸脱氢酶 (AK) 解除反馈抑制，积累代谢产物 如：高丝氨酸营养缺陷型突变株(Hser-)条件解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制 应用渗漏突变株进行代谢调控育种 渗漏突变株(leakage mutant) ：一种遗传障碍不完全的营养缺陷型，其特点是酶的活力下降但不完全丧失，使其能少量合成某一代谢产物，但产物的量又不造成反馈抑制。 优点：不需要限量添加生长因子。 筛选： 营养缺陷型突变株→诱变→ 挑选在MM上生长缓慢且菌落小的回复突变株 不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平 突变菌株 突变型 产量(mg/ml) 钝齿棒杆菌 Hse- 17.93 钝齿棒杆菌 Thr - 2.33 钝齿棒杆菌 Thr - +Met - 2.00 钝齿棒杆菌 AECr 20.0 AECr, Hse- 50.0 北京棒杆菌 Hse- 36.6 Hse-,AECr 45.0 二、营养缺陷型的筛选 诱变处理：同前 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟） 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养4~6小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀 淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩 检出缺陷型 鉴定缺陷型 淘汰野生型 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去 方法： 差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。 将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发不被杀死。 抗生素法：青霉素能杀死生长态的细菌而对休止态的细菌无作用 菌丝过滤法：适用于丝状真菌 将诱变后的孢子接种至MM中，控制培养时间，使野生型长成菌丝体，通过过滤而除去菌丝体，反复几次后，剩余的多为缺陷型孢子。 饥饿法： 抗生素淘汰野生型 饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养1-2小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”； 加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。 制霉菌素可用于处理酵母菌和霉