林业生物技术 知识课件8.基因工程基本技术 知识.pptVIP

1、植物核酸提取 1、植物核酸提取 28sRNA、18sRNA、5.8sRNA是rRNA，并且理论上讲28S条带的亮度应该为18S条带亮度的1～2倍，否则，当18S条带的亮度过高时说明28SrRNA可能降解为18SrRNA了，意味着RNA可能严重的降解了。 最后，这三条带代表的是总RNA的提取程度，不能说明mRNA的提取量。 2、基因扩增 ① 在体外应用聚合酶链式反应技术和合成的寡核苷酸引物，导致特定的拷贝数发生快数大量的扩增。 ② 通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上并转化到适当的寄主细胞，在体内大量复制 ③ 在外界环境胁迫下，真核生物有关细胞被诱发产生适应性发应，从而导致相应的保卫基因产生明显扩增。 ④ 程序基因扩增。 ⑤ 在生物进化过程中发生基因加倍。 基因扩增的几种情况： 2、基因扩增 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）：PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 穆利斯（Kary B. Mullis） 2、基因扩增 该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y－产量; X－扩增效率; n－循环次数。 2.1 PCR技术基本原理 2、基因扩增 Taq DNA 聚合酶－Taq polymerase (Thermus aquaticus ) 四种脱氧核苷三磷酸混合物－dNTPs 引物－Primers 盐离子－salts (ions)，一般为Mg2+ 模板－DNA fragment 无菌双蒸水－SDW（sterilization double water） 2.2 PCR反应体系的准备 2、基因扩增 套式PCR：即巢式PCR或嵌套PCR，用两对引物先后扩增同一样品。 原位PCR：对组织细胞中特异DNA或RNA进行PCR扩增，然后直接检测或用原位杂交对扩增产物进行分析的一种方法。 多重PCR：同时扩增模板上的多个靶基因。 定量PCR：通过PCR扩增来定量扩增体系中的DNA或RNA的启始拷贝数量。 RNA PCR：即反转录PCR或RT-PCR，将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2.3 常用PCR技术 2、基因扩增 ?用于合成特异探针 ?用于DNA的测序 ? 将逆转录与PCR相偶联 （RT-PCR） ?用于基因定位诱变 ?末知序列的PCR扩增 ?基因组序列的比较研究 ?用于临床诊断 2.4 PCR技术的发展与应用 2、基因扩增 PCR仪器 ① ② ③ ④ 3、核酸凝胶电泳 3.1 基本原理 在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动。 电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。 3、核酸凝胶电泳 在生理条件下，核酸分子之糖－磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA是多聚阴离子。 在电场中，向正电极迁移。糖－磷酸骨架结构具有重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，也以相同的速度向正电极移动，在一定的电场强度下，核酸迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。 分子量小，迁移速度快，分子量大，迁移速度慢。 相同分子量不同构型的DNA迁移速度：环形＞线性＞开环形 。 3、核酸凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖：线性多糖聚合物，从红色海藻中提取出的。较低温度便会熔化，冷却便凝固，良好的电泳介质。 分辨率0.2－50kb。 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 分辨率1－1000bp。 脉冲电场电泳：分离大片段的核酸，可以分离整条染色体（10000kb） 电场方向、电流大小、作用时间交替变换。 3.2 核酸电泳种类 电泳注意问题： 1、凝胶完全干后，才能拔电泳梳 2、需经常更换电泳缓冲液 3、防止做胶时有气泡 4、做胶的缓冲液与电泳缓冲液应匹配 ① ② ③ ④ 3、核酸凝胶电泳 电泳仪器 ① ② ③ ④ ⑤ 3、核酸凝胶电泳 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 * 1 2 植物核酸提取 3 核酸凝胶电泳 4 DNA核苷酸序列分析 基因扩增 2、Sanger的双脱氧 测序原理？ 1、什么是琼脂糖？ 电泳的基本原理是什么？ 3、PCR的基本原理？ 思考与讨论 1、植物核酸提取 1、植物核酸提取 1.1 CTAB法提取植物基因组DNA 植物组