第07章 色谱分离技术 知识 生物分离工程ppt.pptVIP

第07章 色谱分离技术目 录;7.1 基本原理;色谱分离基本特点 ; 吸附色谱是指混合物随流动相通过固定相吸附剂时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离。; 离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。 该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。 离子交换色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。 ; 色谱和电泳是目前最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。但电泳法目前尚不能用于生产规模的分离与纯化，因而色谱技术成为分离和纯化蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质的核心手段。;(2) 色谱分离方法的选择;色谱分离原理示意图 ; 被分离的混合物在流动相携带下通过固定相时，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：;在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示：; 凝胶色谱分离原理示意图 ;(7-28) ;工业规模色谱大多采用柱色谱法。; (一)无机基质吸附剂;(二)有机基质吸附剂; 纤维素是β-1，4键相连的D-葡萄糖(偶而有1，6键合)的线性聚合物，具有很高的孔度和亲水性。机械强度比葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都好。它同样可以进行化学修饰，以满足不同的需要。 纤维素及其众多的衍生物已被广泛地用于蛋白质类物质的纯化。; 柱色谱装置一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。;(一)进样及流动相供给装置; 溶剂性质须适应所用固定相，大量样品溶液导入色谱柱后不马上扩散，集中在柱头，不会在柱内展开。;洗脱展开流出曲线 ; 在前沿分析法中，样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，样品溶液本身起流动相的作用。当溶液通过固定相时，不同组分根据与固定相作用力强弱不同，产生不同的移动速率。;三组分前沿分析流出液组成图形 ; 与洗脱展开法差别不大， 主要的不同之处是样品输入色谱柱后，用一??与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂推动下沿色谱柱前进，因样品各组分的作用力不同，向下移动的速率也就不同，最先从柱中被置换出来的是作用力最弱的溶质，最后出来的是置换剂本身。以流出液体积对溶质浓度作图，也可得到一阶梯图，每一个阶梯只有一种成分。;7.1.5.4 洗脱色谱动力学;根据传质理论，色谱分离的传质过程可表示为：;(7-53); 实际色谱过程中存在传质阻力(如固定相表面液膜扩散和内扩散)，溶质在两相间的分配平衡不可能瞬间完成，而需要一定的柱高。 通常将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段称为一个理论板(theoretical plate)，该柱段高度即理论板当量高度(heigh equivalent to a theoretical plate，HETP)。设高度为L的色谱柱的理论板数为N，则;当实测得到理论板数N后，即可利用式(7-56)计算理论板当量高度HETP。;HETP与流速的关系;分 离 度(resolution); 在实验室规模的小型色谱分离实验成功后，要扩大应用到工业规模的生产上，必须进行有科学依据的放大。在分离能力扩大同时，要尽可能维持产物收率和纯度不改变。 提高给料流量是增加生产能力的更有效的方法。要维持产物纯度，需要待处理物料中各组分的色谱浓度分布不能有大的改变。 ;径向色谱柱中，样品和流动相是从柱的圆周围流向柱圆心，可在较小的柱床层高度时使用较大的流动相流速；同时因圆柱表面积一般大于其横截面积， 在流动相保持较高的体积速率时，反压降较低；当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，可以线性增大样品处理量，样品的规模可在保持相似的色谱条件下直接放大，各组分的保留时间及分辨情况与小试时完全相同。;径向色谱操作装置示意图 1—预平衡液 2—样品 3—流动相 4—阀 5—泵 6—径向色谱柱 7—流量计 8—压力表 9—检测器 10—记录仪;7.2 分配色谱(Distribution chromatography); 反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种 物质。 RPC做为定量分析手段，广泛应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。做为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规律工业生产中应用较少。;7.3 凝胶过滤(GFC); G