基质金属蛋白酶3-mmp3在抗登革病毒感染中的作用及机制的分析-analysis of the role and mechanism of matrix metalloproteinase 3 - m mp3 in anti-dengue virus infection.docx

中文摘要登革病毒是当今世界上分布最广的一种虫媒传染病毒，主要由叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。据WHO估计，全球每年新增数百万的登革病毒感染者，因登革病毒感染导致死亡的人数约2.5万。目前，登革病毒感染的机制仍不明确，由于各血清型之间缺乏有效的交叉保护，又存在抗体依赖的增强作用等，至今仍无安全有效的疫苗可用。因此，研究宿主抗登革病毒的分子机制，对于了解登革热的发病过程具有重要意义。我们实验室从JAK-STAT信号通路入手，来研究宿主细胞抗登革病毒感染的分子机制，着重关注包括基质金属蛋白酶3（MMP3）在内的几个JAK-STAT下游效应分子在抗登革病毒感染中的具体作用。我们研究在登革病毒感染巨噬细胞前后，84个JAK-STAT相关基因的表达变化。结果显示基质金属蛋白酶MMP3表达上调了3.68倍。为了进一步验证PCR芯片的结果，我们又用定量PCR的方法在多种细胞中证明了MMP3在登革病毒感染的细胞中表达上调。抑制MMP3的表达，病毒的感染水平显著上升；而在RAW264.7细胞中过表达MMP3又可以抑制登革病毒的复制，这就揭示MMP3具有抗登革病毒感染的作用。为了了解MMP3抗病毒的分子机制，我们分别检测了MMP3沉默的细胞和对照细胞经登革病毒感染后，代表性抗病毒相关细胞因子的表达。结果发现，MMP3沉默的细胞中，抗病毒相关细胞因子和趋化因子的表达水平显著降低。免疫荧光发现MMP3在登革病毒感染的细胞中会发生从细胞质到细胞核的迁移；而且双荧光素酶报告基因检测结果显示，在病毒感染的细胞中，沉默掉MMP3，NFκB的转录活性下调，过表达MMP3又可以很强地激活NFκB。鉴于以上这些结果，我们推测MMP3很有可能是通过进入细胞核来影响NFκB的转录活性从而达到抗病毒作用。在后续实验中通过采用荧光定位和免疫共沉淀的方法得到了MMP3与NFκB在登革病毒感染的细胞中存在相互作用的结果。MMP3由信号域，前肽域，催化域，铰链区和羧基末端域等5个结构域组成，为了检测与NFκB相互作用的结构域，我们构建了含MMP3各个结构域的质粒，中文摘要基质金属蛋白酶3-MMP3在抗登革病毒感染中的作用及机制研究并分别与NFκB的两个亚基（P50;P65）共转染293T细胞进行免疫共沉淀实验。结果显示MMP3主要依赖于其羧基末端域与NFκB相互作用。进一步的报告基因检测实验结果显示：MMP3的羧基末端域可以更强地激活NFκB。本研究首次揭示了MMP3进入细胞核发挥抗病毒效应的全新功能，为MMP家族参与免疫调控提供新的证据，而且MMP3分子的表达水平有可能成为登革热疾病进程的诊断靶标，MMP3相关激动剂也将有可能应用到抗病毒感染的应用当中。关键词：登革病毒；MMP3；NFκB；作者：左向阳指导教师：戴建锋Theanti-viralfunctionandmechanismofMatrixmetalloproteinase3duringDenguevirusinfectionAbstractDenguevirus,transmittedbytheAedesaegyptiandAedes,isoneofthemostwidelydistributedinsect-bornevirusintheworld.AccordingtothestatisticsofWHO,50-100milliondengueinfectionsareestimatedtooccureachyearandapproximately25000peopledieofinfection.Currently,themechanismofdenguevirusinfectionremainsunclear.Duetolackofeffectivecross-protectionbetweenserotypesandthepresenceofantibody-dependentenhancement,thereisstillnosafeandeffectivevaccineavailable.Therefore,thestudyofmolecularmechanismsabouthostanti-denguevirusinfectionisveryimportant.OurlaboratoryfocusedontheroleandmechanismofJAK-STATpathwayduringDENVinfection.Westudiedtheexpressionof84JAK-STATrelatedgenesinmacrophagecelllineRAW264.7cellsduringDENVinfection.Amongthem,theexpressionofMMP3increasedby3.68fo