急慢性酒精中毒大鼠脑组织nnos hsp70表达与tsah死亡关系的研究-study on the relationship between nnos hsp 70 expression and tsah death in acute and chronic alcoholism rats.docx

摘要背景与目的随着酒精饮料消费的不断增加，酒后暴力事件逐渐增多，特别是酗酒后轻微外力所致 的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage, TSAH)死亡案件常有发生， 且已引起当前国内外法医工作者注意和重视。许多学者定义 TSAH 为较轻的钝性外力打击 引起的致命性弥漫性蛛网膜下腔出血，其典型特征为发生于酗酒后。本课题组已建立稳定 的大鼠灌酒后 TSAH 模型，结果为灌酒后大鼠 TSAH 出血率：慢性组 82.4%、急性组 28.6%； 死亡率：慢性组 58.8%、急性组 0，表明慢性灌酒 TSAH 死亡率远大于急性灌酒组。但是 慢性灌酒大鼠 TSAH 高死亡率机制尚不完全清楚。由于国内外未见相关的研究报道及系统 研究，同时给法医学死因分析、司法审判量刑带来一定的困难。这正是关于 TSAH 案例法 医学鉴定、死因分析，及其司法审判量刑中极其重要而迫切需要解决的问题之一。据此， 进行课题立项，深入探讨灌酒大鼠 TSAH 的高死亡率机制。鉴于前期对死亡机制的研究工作主要从慢性灌酒后神经元量能代谢、凋亡、血管生物力学以及暗神经元方面展开，并取得了相应的成果。机体抗应激能力对于生物的生存具有 重要意义。然而，从长期慢性灌酒后致机体应激变化方面探讨慢性灌酒高死亡率机制报道 较少。本研究旨在前期所建立的大鼠灌酒后 TSAH 模型基础上，通过观察大鼠慢性灌酒后 nNOS 和 HSP70 的表达情况，从慢性灌酒后应激的改变、应激改变对机体的影响等方面进 一步的探讨死亡机制，以期为此类案件的法医学鉴定和临床防治提供科学理论依据。材料与方法1 实验动物及分组情况SPF 雄性 SD (Sprague-Dawley)大鼠 61 只，体重 300±50g，分笼饲养，随机分为急性和 慢性组。急性组再分为急性灌酒打击组、急性单纯灌酒组、急性灌水打击组、急性单纯灌 水组 4 组，每组 7 只，共 28 只；按 15ml/Kg 一次性给予胃内灌注。慢性组分为慢性灌酒打击组、慢性灌酒停酒打击组、慢性单纯灌酒组，分别为 19 只、7 只及 7 只计 33 只；其 中慢性灌酒打击组和慢性灌酒停酒打击组根据打击后存活情况分为打击死亡组和打击存 活组。慢性灌酒组连续灌酒 4 周、日两次间隔 8h，前 2 周 8ml/kg/次、后 2 周 12ml/kg/次。I2 实验方法打击大鼠于最后一次灌胃 2h 或 12h 后，使用自制单摆行脑震荡性打击。打击死亡大 鼠即刻开胸左心室取血约 5ml，断头取脑并置于 4%中性多聚甲醛。打击未死亡大鼠观察 4h 后同单纯组大鼠用乙醚麻醉后，开胸暴露心脏、左心室取血约 5ml；经主动脉滴注 4% 中性多聚甲醛固定后，断头取脑并置于 4%中性多聚甲醛固定。将脑组织制作石蜡切片， 分别行 HE 染色观察及 nNOS、HSP70 免疫组织化学染色、血乙醇浓度检测。病理真彩色 图像分析系统 4.0 病理学观测；Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件测量总积分光密度(SUM IOD)和平均积分光密度(MENA IOD)；SPSS15.0 (Independent-samples T-test and One-way ANONA)及 Excel 2003 分析处理实验数据。结果1 实验大鼠一般情况观察1.1 灌酒一般状态急性组大鼠灌酒后早期兴奋性增强、好动、处于警觉状态，约 0.5h 后精神萎靡，步态 不稳、迟缓，肌张力降低出现侧卧、昏睡、翻正反射消失、对刺激反应迟钝，血压降低， 约 6h 逐渐恢复正常。慢性组大鼠出现进行性营养不良、胃肠功能紊乱、精神萎靡和活动 减少等。1.2 体重情况慢性组大鼠灌酒期间体重持续下降(P0.01)，其中第 1w 及第 3w 下降最显著。急性组 大鼠体重呈缓慢增长(P0.05)，至第 4 w 增长较为明显(P0.05)。1.3 血压变化急慢性灌酒组大鼠尾动脉压(Caudal Arterial Blood Pressure, CABP)灌酒后 2h 的 14.13±0.34 kPa 较灌酒前 0.5h 的 17.02±0.88 kPa 显著降低(P0.01)；打击后 4h 与灌酒或水 前 0.5h 血压差异不明显(P0.05)。急性灌水组灌水前后血压无明显变化(P0.05)。慢性灌酒 组大鼠 CABP 自灌酒自第 3w 起明显升高持续至第 4w 达 18.16±0.82 kPa 比灌酒前的 16.60±0.76 kPa 升高明显(P0.05)。1.4 大鼠血乙醇浓度慢性灌酒打击存活组血乙醇浓度(Blood Alcohol Concentration, BAC) 为 60.08±13.80 mg/dL 较急性灌酒打击组 BAC 为 40.90±13.2 mg/