细胞融合1课件.pptVIP

二、细胞融合（原生质体融合）的发展历史 1909年，Kuster用低渗NaNO3溶液引起原生质体的融合。 1972年，Carlson等用NaNO3融合方法获得了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种。 但NaNO3法异核体形成率低，且对细胞有毒害。 1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5 mM CaCl·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原质体，获得种内及种间体细胞杂种。 该方法异核体形成率低，对细胞有毒害。 1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。因此，该方法迅速展开。 1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯体细胞杂种。 1979年，Senda发现电融合方法。由于对细胞无毒害，已广泛应用。 目前，种内、种间、属间体细胞杂种已在许多植物上成功。 二、细胞融合的意义 1、克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如野生种的有效利用等） 2、可缩短育种年限 3、利用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。 二、细胞融合的方法 （一）、自发融合 在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体（可包括2~40个核）。这种融合称为自发融合，或自体融合，是由于细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。 （二）、诱发融合 1、? 盐类融合法 应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。 NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2、葡萄糖硫酸钠、葡萄糖硫酸钾等。 2、高pH—高钙离子融合 CaCl2?2H2O 0.05 mol / L，pH 9.5—10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。 由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。 3、? 聚乙二醇融合法（PEG法）? PEG融合液 PEG6000 30% Ca(NO3)2?4H2O 0.1 M 甘露醇 0.4—0.6 M pH 10.0 具体操作方法： 分离纯化的两亲本原生质体以一定比例，一般1∶1混合，用W5洗涤液调至密度约为106个/ml → 一滴一滴滴入培养皿中，其上加一滴融合液，融合10分钟 → 用W5洗涤液洗涤2次，液体培养基洗涤1次 → 培养。 * * 第六章?? 原生质体培养及融合 ? 原生质体：除去细胞壁的“细胞” 原生质体融合，也称为细胞融合，或体细胞杂交 第一节?????? 原生质体培养 一、原生质体培养的发展历史 要进行原生质体培养，首先要分离原生质体，即去除细胞壁。 1892年，Klercker采用机械法剥离原生质体，但效率特低。 1960年，Cocking证实了用酶解法可以由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。 1968年，纤维素酶、离析酶投入市场后，使原生质体分离简单化，原生质体培养成为了热门研究领域。 1971年，Takebe从烟草叶片分离原生质体，首次获得了原生质体再生植株成功。 随后，其它植物也逐渐再生成功。 二、原生质体培养的意义 1、为细胞融合提供培养方法 2、为遗传转化提供培养方法 原生质体由于没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，电穿孔法、PEG法等基因转化方法是以原生质体作为受体细胞。 3、利用培养变异选育新品种 4、 用于细胞器的分离与转移 原生质体由于没有细胞壁的障碍，可以进行许多遗传操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。摄取后，再进行培养，再生植株。根据再生植株以及后代的表现，进行遗传分析，研究某种细胞器功能或控制的性状等。 也可以转移以上细胞器，培育新品种。 5、 用于理论研究 细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染机理等。 原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等研究领域得到广泛应用。 三、原生质体的分离 1、取材：试验材料对原生质体培养非常