质粒DNA的分离纯化和电泳检测.docxVIP

分子生物学实验报告质粒DNA的分离、纯化和电泳检测姓名： 班级： 学号： 指导老师： 同组者： 年 月 日摘 要提取和纯化质粒DNA的方法很多，其中碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，且提取质粒DNA纯度高，一般实验室均可进行。该方法利用染色体DNA与质粒DNA变性与复性所依赖的溶液pH值不同来将染色体DNA沉淀，再经过一系列除杂的方法除去RNA及其它蛋白质杂质从而得到质粒DNA。而琼脂糖凝胶电泳是一种常用的纯化和检测DNA的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。样品DNA分子的大小、DNA分子的构象影响DNA的移动速度从而将不同分子大小与构象的DNA分子分离开来。关键词：碱变性法； 质粒DNA； 凝胶电泳1．原理与方法1.1 质粒载体质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个双链闭合环状小分子DNA，其大小从1kb至200kb以上不等。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外，质粒DNA上携带了部分的遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状，如性菌毛形成、形成耐药性、产生细菌素、抗生素等。通常情况下可持续稳定地复制，但在一定条件下也可可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒还可通过接合或转导的方式在细菌间传递。质粒由于分子小、便于分离和提取，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此是基因工程中一种非常重要的载体，质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA，质粒提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。1.2 碱变性提取法提取质粒提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4.6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。1.3 凝胶电泳法进行DNA的分离纯化电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的