研究生实验三重组质粒DNA提取、双酶切鉴定讲解课件.pptVIP

重组质粒（PUC119-U6） BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III PUC119（3.2Kb） U6启动子（256bp） 2.2 实验材料: (1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。 * 2.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容） * 2.4 双酶切体系 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl * 合计 20μl 准备室老师已加好 同学自己加 实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。 思考题？ 为什么要用双酶切而不是单酶切割重组质粒DNA？ * * 质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒 朱文博 中山医学院 基因克隆 定义： 经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。 基因工程 定义： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组DNA技术。 基因克隆示意图 分、切 接 转 筛 基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 实验内容 2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82) 3.定性鉴定:DNA的琼脂糖凝胶电泳 4.定量检测：DNA的紫外分光光度法测定(P39) 1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法) 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用 ; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶 一.质粒DNA的提取 1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？ * 1.1 质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 * (1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 1.2 质粒的三种构型 * (2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。 * (3) 线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） * 最快 中 最慢 1.3 质粒DNA的基本特征： (1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制； (2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝 松弛型复制-复制数十个拷贝； (3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞； (4) 不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。 * * 1.4 理想的克隆载体： (1) 分子质量