离心技术-09242016.pptVIP

第五章离 心 技 术 免疫研究室　易浪 离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。 第一节 离心技术的基本原理 分离、纯化样品; 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。 悬浮颗粒在液体介质的扩散运动 一、离心的一般原理 颗粒越小，则沉降越慢，扩散现象越严重。 颗粒运动的方向和速度 颗粒的密度、形状、大小 液体介质的密度、粘度和重力场的强度 1、离心力和相对离心力 离心力(centrifugal force，F) 指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力，由下式计算： 相对离心力( relative centrifugal force，RCF) ：在离心场中颗粒所受的离心力相当于它受到的地球重力的倍数。（×g ） F = m w2 r ω:旋转角速度 (弧度／秒) r:旋转体离旋转轴 的距离(cm) m:颗粒质量 2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S) 沉降系数是指在单位离心力作用下，待分离颗粒的沉降速度 。 S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位(S)，即 l S = 10-13秒。在生物学各种论文中常见的某物质沉降系数为多少个S，即指此单位。 颗粒的半径 颗粒的密度 介质的密度 溶液的粘度 S 的数值受颗粒的相对分子质量和形状等特性的影响。 预计沉降时间； 测定物质相对分子质量。 3、沉降速度（sedimentation velocity, v） 沉降速度是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。 颗粒的半径 颗粒的密度 介质的密度 溶液的粘度 4 、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr） 沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。 用于差速离心实验 离心机的分类 按转速分为低速、高速和超速三种； 按用途分为实验型和工业型两种，前者分为分析型和制备型两种； 按使用温度分为常温和冷冻两种； 按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气动式、电动式和磁悬式等。 第二节 离心设备 preparative ultracentrifuge 转头 驱动装置 速度控制系统 冷却装置 真空装置 光学检测系统 离心机的构造 a 水平转头 b 角式转头 c 垂直转头 角度在14-40℃ 之间 离 心 转 头 学生实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大的沉淀物等。 玻璃离心管 用于速度较低的离心，具有管壁 光滑、透明和易清洁等优点，但易破碎，故不能用于高速离心。 塑料离心管 超速离心时，离心管需要封口。由于制造离心管的塑料材料很多，如聚丙烯、聚乙烯、硝化纤维素、尼龙等，其各有自己的理化特性和对各种实验试剂的化学稳定性。 不锈钢离心管 强度大，刚性好，通常对碱的 耐受较好，抗酸性较差。使用时配对使用。 离 心 管 选用离心管时应考虑的因素： 容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满 形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度梯度离心时圆底离心管更有用 最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书 灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。 透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明 能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管适合 管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管 使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。 检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管放入离心套管内，位置要对称。 盖上离心机盖子，调零，接通电源,缓慢加速到所需速度。 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即切断电源，待检查排除故障后方能使用。 离心机的使用及注意事项 制备离心技术：是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。 第三节 常用离心方法及应用 制备离心技术 一般制备离心技术 制备超速离心技术 差速沉降离心 密度梯度区带离心 差速区带离心 等密度区带离心 概念：简称区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 密度梯度离心法