生物显微镜技术2-其他常用制片方法与特殊染色方法.pptVIP

第二章 其他常用制片方法和特殊染色方法 第一节 其他常用制片方法 一、冰冻切片法 冰冻切片法是以水为包埋剂，将已经固定或新鲜的组织块借助低温冷冻使其达到一定的硬度，然后在切片机上切片的一种方法。 在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。 不经过脱水和透明步骤，组织没有收缩，易保持生活的原有形态，尤其在免疫组织化学染色中，能较好的保存细胞抗原的免疫性，所以是保存脂肪组织、神经组织特别是酶的活性十分理想的切片方法。 （一）冷冻切片的种类 半导体冰冻切片机 低温恒冷箱冰冻切片法 二氧化碳冰冻切片法 甲醇循环制冷冰冻切片法等 这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 （二）冷冻切片的制作方法低温恒冷箱冷冻切片制作法 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。 操作方法及步骤：（1）取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 （2）速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 常用的骤冷剂有：① CO2气（－78℃） ② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃） ③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）。 液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。如组织块小可适量加OCT包埋剂 （3）切片： ①取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。②将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ③调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 ④调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。  ⑤应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定 （4）染色：切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4℃丙酮固定10min，待干燥后便可根据需要进行不同染料染色或用锡纸包好封存于-20℃冰箱。 方法：① 切片固定30秒～1分钟。 ② 水洗。③ 染苏木素3～5分钟。④ 分化。⑤ 于碱水中返蓝20秒。⑥ 伊红染色10～20秒。 ⑦脱水，透明，中性树胶封固。 冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。 （5）冰冻切片时的注意事项：①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净。②组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。  ③当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 ④用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。 （三）冰冻切片的优缺点： 优点： 1、简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 2、快速，用时短。 3、组织变化不大。 4、能很好保存脂肪，类脂等成分。 5、能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 缺点： 1、不容易做连续切片。 2、切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 3、不容易制作较薄的切片。 4、组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原